Методика заливки агарозного геля
Взвесить рассчитанное количество порошка агарозы (1 г для подготовки 100 мл 1% геля) и высыпать в химический термостойкий стакан. Налить в стакан 5 мл 10кратного электрофорезного буфера TBE и довести до 100 мл водой.
Нагреть смесь на электроплитке или СВЧ-печи до полного расплавления.
Охладить расплавленную агарозу до 60-650С (стакан можно держать в руках). Добавить бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл: следует взять 5 мкл из стокового раствора бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл на 100 мл расплава.
Установить гребѐнку ≈ в 1 см от края формы. Аккуратно вылить расплавленную агарозу.
На одном из краев заливочной камеры (Рис.17) устанавливают гребенку – при этом между концом зубчиков и дном заливочной камеры должен оставаться зазор 0,3–0,5 см. Далее аккуратно заливают в форму раствор агарозы c t=60-650C толщиной не более 4–5 мм. После того как гель полностью полимеризуется (около 30 мин.), его помещают в электрофоретическую камеру и заливают буфером (0,5ХТБЕ) так, чтобы он покрыл агарозу сверху слоем 2–3 мм. Осторожно удалить гребѐнку, покачав еѐ из стороны в сторону и потянув вверх.
Рисунок 19. Иллюстрация методики заливки геля и визуализация фрагментов ДНК в ультрафиолетовом свете.
Определение концентрации и качества днк/мРнк в агарозном геле
После выделения ДНК и/или РНК и до проведения дальнейших исследований необходимо определить чистоту препаратов и размер молекул. Загрязняющие примеси в препаратах нуклеиновых кислот могут ингибировать последующие ферментативные реакции с их участием (например, рестрикцию ДНК). ДНК должна быть достаточно высокомолекулярной, чтобы можно было проводить планируемые эксперименты, а РНК — интактной.
Количество и качество НК может быть быстро определено при помощи электрофореза в агарозном геле с последующим окрашиванием этидиум бромидом. Для проведения электрофореза используют 0,8-1% агарозный гель. Для проведения электрофореза РНК желательно использовать отдельную электрофоретическую камеру, так как препараты ДНК содержат очень много РНаз.
1. Приготовить 0,8-1%-ый агарозный гель, используя стерильный ТВЕ буфер. Добавить в гель этидиум бромид до концентрации 0.5 мкг/мл.
2. Залить в электрофоретическую камеру охлажденный ТВЕ буфер.
3. Смешать образец (0,5-2 мкг ДНК/мРНК) с 0,05% бромфеноловым синим и 0,05% ксиленцианолом).
4. Нанести образцы на гель, провести электрофорез при рассчитанном напряжении (~2V/cm геля) и посмотреть гель на УФ-трансиллюминаторе.
ДНК хорошего качества должна быть представлена в виде высокомолекулярного шмера (полосы) равномерной интенсивности.
В препаратах РНК хорошего качества содержание 28S-PHK должно быть примерно в три раза выше, чем 18S-PHK. Если это отношение меньше, значит, РНК частично деградирована. мРНК выглядит как шмер от 8000 до 300 пар оснований (Рис.21). Регион с наибольшей интенсивностью расположен в районе прибл. 2000 пар оснований. мРНК обычно содержит 10-25% примеси рибосомальной РНК (рРНК), видимой на геле в качестве полос в районе 2000 пар оснований (18s рРНК), 5000 пар оснований (28S рРНК) и иногда в районе 100 пар оснований (5S рРНК) (примеси рРНК не влияют функционально на большинство областей применения мРНК). Полосы рРНК обычно не видны после второго раунда очистки.
Рис.21. Электрофореграмма, демонстрирующая проверку качества выделенной РНК (Дорожки 1 – образец ДНК, 2, 3 – образцы РНК, не обработанные ДНКазой, 4, 5 – образцы РНК, обработанные DNAse Ienzyme).