Полногеномное генотипирование полиморфных локусов с помощью микрочипов высокой плотности (на примере Illumina Human610-Quad BeadChip)

К настоящему времени ведущими производителями (Illumina, Affymetrix, Sequenom и др.) разработаны платформы с микрочипами высокой плотности для генотипирования и анализа экспрессии генов (рис. 30)

Illumina Human610-Quad BeadChip включает более 600 тысяч однонуклеотидных полиморфизмов и маркеров вариации по числу копий генов (CNV). Каждый ОНП (SNP) для биочипа отобран на основании точной о нем информации для повышения эффективности определения ассоциации с заболеванием. В геноме человека более 10 миллионов ОНП и изучение каждого полиморфного локуса в геноме экономически нецелесообразно. Компанией Illumina разработан уникальный рациональный подход к выбору ОНП, который обеспечивает высокое качество данных генотипирования и охват всех необходимых локусов для анализа предрасположенности к заболеванию.

Рис.30. Чиповые технологии для высокопроизводительного генотипирования

В состав биочипов Illumina включен набор ОНП, называемых маркерными или таговыми (tag SNP), которые могут быть использованы в качестве прокси-маркеров (маркеров-представителей) для всех распространенных ОНП (с частотой редкого аллеля ≥ 5%) в геноме. Выбор маркерных ОНП основывается на величине неравновесия по сцеплению (r²) между близкорасположенными полиморфными локусами. Высокий уровень r² между двумя ОНП, указывающий на высокую корреляцию, делает эти ОНП хорошими прокси-маркерами. При максимальном r², равном 1, два ОНП находятся в полном неравновесии по сцеплению и могут служить как абсолютные прокси-маркеры, т.е. нужно генотипировать один ОНП, чтобы узнать генотип другого (The Power of Intelligent SNP Selection (www.illumina.com)). Использование маркерных ОНП дает возможность получить максимальное количество информации, высокий уровень покрытия генома и охват генов, а также уменьшить размер исследуемой выборки без снижения эффективности определения генетической ассоциации. Геномное покрытие определяется как количество ОНП, которые находятся в неравновесии по сцеплению с референсным набором локусов. В качестве референсного набора специалисты компании Illumina используют все ОНП, прогенотипированные в проекте HapMap. По данным компании Illumina, биочип Human610-Quad BeadChip обеспечивает покрытие 89% генома в европейских популяциях (CEU, HapMap), 86% генома - в азиатских (CHB+JPT, HapMap) и 58% генома – в африканских (YRI, HapMap) (при r² > 0.8). Среднее расстояние между маркерами на этом биочипе составляет 4,7 т.п.н., медиана – 2,7 т.п.н.

Технология Illumina’s BeadArray основана на использовании 3-микронных кремниевых микросфер (шариков – beads), которые сами собираются в микролунки или на пучках оптических волокон или на плоских кремниевых пластинах. Каждая микросфера покрыта тысячами копий специфических олигонуклеотидов, содержащих локус-специфические и адресные последовательности, по последним из которых определяется, какой шарик в какую микроячейку встроился.

На первом этапе генотипирования проводится полногеномная амплификация образцов ДНК, после которой ДНК фрагментируется (рис.31). На следующем этапе немеченые фрагменты образцов ДНК гибридизуются с соответствующими 50-нуклеотидными зондами, фиксированными на микросферах чипа. После этого для точной идентификации аллеля к тестируемому нуклеотиду с помощью фермента ДНК-полимеразы присоединяется меченый комплементарный нуклеотид. Двухэтапная детекция аллелей каждого маркера – гибридизация с 50-нуклеотидными зондами и последующая ферментативная детекция нуклеотида обеспечивают высокую селективность и специфичность идентификации аллелей (Infinium® HD DNA Analysis BeadChips (www.illumina.com)).

Рис. 31. Схема протокола генотипирования с помощью биочипов Illumina Human610 quad BeadChip (Infinium® HD DNA Analysis BeadChips (www.illumina.com).

*****

Таким образом, в представленном учебном пособии рассмотрены основные молекулярно-генетические методы изучения наследственных болезней человека. В одной книге невозможно описать все существующие на сегодняшний день методы исследования или представить молекулярно-диагностические протоколы для каждой конкретной формы наследственной патологии. Настоящее учебное пособие дает общие представления о методологии и стратегии проведения молекулярно-генетической диагностики, раскрывает методы, наиболее часто используемые в практике современного исследователя. Предлагаемые протоколы проведения исследований, подробное описание различных методик с иллюстрациами, помогут студентам медико-биологического профиля подготовки, специализирующихся по генетике, успешно освоить молекулярно-генетические методы анализа генома человека.