Выделение днк с помощью сорбента

Одним из популярных в настоящее время является также метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента - гуанидина тиоционата (GuSCN) и последующей сорбции ДНК на носителе (например, например, частицами силики (SiO2) в качестве абсорбента). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, т.к. возможна перекрестная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.

Преимущества метода экстракции с помощью силики:

- быстрота выполнения;

- простота исполнения;

- экономичность;

- возможность автоматизации.

Недостатки метода экстракции с помощью силики:

- сложно выделять ДНК из объектов с малым количеством биологического материала.

Выделение ДНК с помощью ионообменной смолы

Другая группа методов основана на использовании ионообменников типа Chelex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а, наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца, в результате чего клеточные стенки разрушаются, а нуклеиновые кислоты выходят в раствор; и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, клеточные стенки некоторых микроорганизмов не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, допускается использование простых методов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время, использование подобных методов выделения ДНК для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам, вследствие использования в реакционной смеси некачественного препарата ДНК.

Преимущества метода экстракции с помощью ионообменников:

- безопасность, простота, быстрота;

- возможность автоматизации процесса;

- дешевизна;

- практически исключена возможность контаминации;

- удаляет ПЦР-ингибиторы;

- можно использовать для всех типов объектов, кроме кости.

Недостатки метода экстракции с помощью ионообменников:

- получается очень грубая, неочищенная ДНК;

- непостоянство степени эффективности экстракции (количество и качество ДНК сильно варьирует);

- высокая вероятность ингибирования самими смолами;

- потенциальная нестабильность ДНК и ее деградация со временем;

- полученная ДНК – одноцепочечная, нельзя использовать для ПДРФ-анализа;