Выделение днк фенол-хлороформной экстракцией
Стандартной и, ставшей уже классической, считается методика получения чистого препарата ДНК, предложенная Marmur (год). Она включает в себя ферментативный протеолиз клеток с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Однако это метод довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле. Применение фенола и хлороформа при выделении НК способствует созданию двухфазной системы (рис.1). Белки экстрагируют смесью фенола, хлороформа, изоамилового спирта. Поскольку плотности этих органических растворителей отличны от плотности воды, при центрифугировании лизата клеток, к которому были добавлены фенол и хлороформ, образуется два отдельных слоя: нижний, представляющий собой раствор на основе органических растворителей, и верхний, содержащий водный раствор. При этом белки денатурируют и образуют преципитат, который располагается узкой полосой на границе водной и органической фаз.
Рис. 1. Схематичный процесс выделения нуклеиновых кислот методом фенол-хлороформной экстракции
Если фенол уравновешен буфером с нейтральным значением pH, то водная фаза содержит сразу и ДНК, и РНК. Если же фенол уравновешен буфером, имеющим кислое значение pH, то ДНК окажется в нижнем, органическом слое, а РНК – в верхнем, водном. Используют осаждение ДНК этанолом (изопропанолом) в присутствии соли (ацетата натрия) с дальнейшим отделением осадка центрифугированием и растворением осадка
Преимущества метода экстракции органическими растворителями:
- получение ДНК хорошего качества и высокой концентрации;
- подходит для разных объектов;
- хорошо работает со старым, разложившимся материалом;
- выделенная ДНК очень стабильна и хорошо хранится в замороженном состоянии.
Недостатки метода экстракции органическими растворителями:
- высокая токсичность;
- занимает много времени;
- не всегда удаляет ингибиторы;
- возможна контаминация (большая смена наконечников и пробирок);
- трудно автоматизировать.
Методика выделения днк методом фенол-хлороформной экстракции из лейкоцитов крови (Mathew c.C., 1984).
Смешать 5 мл крови с 30 мл холодного лизирующего буфера. Центрифугировать при 4000 об/мин., при +4°С в течение 20 мин. Если центрифуга без охлаждения, то предварительно подержать пробирки с кровью и лиз. буфером в морозильнике 10 минут.
Слить супернатант, добавить к осадку 20 мл холодного лизирующего буфера, перемешать, центрифугировать при 4000 об/мин., при +4°С в течение 10 мин.
Тщательно слить супернатант и ресуспензировать ядерный осадок в 800 мкл буфера для протеиназы К (Soline EDTA).
Перенести осадок с Soline EDTA в эппендорф на 2 мл, добавить 80 мкл 10% SDS и 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл) слегка перемешать, добавить Soline EDTA до 1 мл.
Инкубировать при 37°С в течение 12 часов.
Добавить 1000 мкл забуференного фенола (фенол-Триs-HCl, pH 7,8, меркаптоэтанол (на 50 мл фенола-Триs-HCl добавить 200 мкл меркаптоэтанола, тщательно перемешать)).
Перемешивать в течение 10 мин. до однородной массы на ротаторе.
Центрифугировать при 5 000 об/мин. в течение 10 мин.
Супернатант перенести в другой (новый) эппендорф, добавить 500 мкл забуференного фенола, 500 мкл хлороформа-изоамилового спирта (24 мл хлороформа: 1 мл изоамилового спирта, тщательно перемешать).
Перемешивать в течение 10 мин. до однородной массы на ротаторе (не трясти!!!)
Центрифугировать при 5 000 об/мин. в течение 10 мин.
Супернатант перенести в другой (новый) эппендорф, добавить 1000 мкл хлороформа-изоамилового спирта.
Перемешивать в течение 5 мин. до однородной массы на ротаторе.
Центрифугировать при 3 000 об/мин. в течение 3 мин.
Супернатант перенести в коническую колбу (на 50 мл), добавить 2-3 мл охлажденного 96% этанола. Плавно перемешивать до образования «медузы» ДНК.
Осторожно слить спирт, оставив «медузу» в колбе.
Промыть осадок 2 мл 70% спирта для удаления солей, плавно перемешивая.
Промыть «медузу» ДНК 96% спиртом 1-2 раза,перенести в эппендорф.
Высушить ДНК (при комнатной температуре) и растворить в деионизированной воде или буфере ТЕ.
Методики приготовления реактивов для выделения ДНК представлены в приложение (Приложение 1).