Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (пдрф-анализ)
Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов – метод обнаружения мутаций, основанный на сопоставлении профилей полос после разрезания геномной ДНК специфичными эндонуклеазами рестрикции - рестриктазами.
В 1962 году Арбер выявил особый тип ферментов — рестриктазы, которые способны разрезать молекулы ДНК только в тех местах (сайтах рестрикции), где имеется определенная последовательность нуклеотидов. Однако активное использование рестриктаз для анализа ДНК началось в 70-х годах.
Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы (от лат. Restrictio — ограничение) — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза НК. В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине. При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его. Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина (маскированием).
Для обозначения рестриктаз используют три первые буквы из названия вида бактерии (например, BglII – из Bacillus globigi, EcoRI – из E. coli), после которых следуют определенный буквенный символ, обозначающий генетическую линию или штамм, и римская цифра. В приложениие (Приложение 4) представлены основные используемые рестриктазы и их сайты рестрикции.
Известно три основных типа рестриктаз: I тип – узнают специфичную последовательность и разрезают ДНК неподалеку от нее, но само место разреза не строго специфично; II тип – узнают последовательность и разрезают ДНК в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности; III тип – разрезают ДНК, отступив определенное число нуклеотидных пар от конца специфичной нуклеотидной последовательности.
Для научных исследований в основном используют рестриктазы II типа, которые узнают палиндромные последовательности (обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии).
Рестриктазы расщепляют ДНК в сайтах рестрикции, расположенных вдоль всего генома. Миллионы полученных таким образом фрагментов ДНК разделяются посредством электрофореза в агарозных и ПААГ гелях. Так как фрагменты проявляют себя в виде непрерывных полос при окрашивании бромистым этидием, полиморфизм невозможно обнаружить только лишь посредством окрашивания. Для каждой рестриктазы существуют оптимальные условия реакции (температура, состав буфера), которые приводятся в описании, прилагаемой фирмой-изготовителем. Для подбора условия гидролиза ДНК рестриктазами можно воспользоваться программой DoubleDigestTM, которую можно найти на сайте www.fermentas.com.
Единица активности рестриктазы – это количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК в реакционной смеси 50 мкл при оптимальных условиях (обычно при 370С) за 1 час.
Рестриктазы хранятся при -200С в буфере с 50% глицерина. Ферменты, вынутые из морозильной камеры, следует держать только во льду и не дольше, чем это необходимо. Объем добавляемых рестриктаз не должен превышать 1/10 от объема реакционной смеси, иначе избыток глицерина ингибирует реакцию.
В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может происходить разрыв двойной спирали ДНК.
Разновидностью ПДРФ-анализа является ПЦР-ПДРФ – ферментативный метод анализа однонуклеотидных полиморфных вариантов (SNP’s) и мутаций, в основе которого лежит использование ПЦР.
Под полиморфными вариантами понимают такие варианты последовательности ДНК, которые распространены в общей популяции с частотой не менее 1%. SNP – это варианты последовательностей ДНК у разных людей с вовлечением одной пары оснований. Данные вариации встречаются на протяжении всей ДНК, как в экзонах и интронах, так и в регуляторным областях и межгенных промежутках. SNP в геноме человека встречаются с частотой в среднем 1 замена на 600 – 1200 п.н., являясь важным источником вариаций между людьми. Метод анализа известных SNP используется для изучения многих мультифакториальных заболеваний.
Рестрикции в реакции ПЦР-ПДРФ подвергаются продукты амплификации, а не геномная ДНК.
Благодаря простоте и надежности метод получил широкое распротранение и до сих пор используется для анализа аллельного полиморфизма генов у самых разных объектов (рис 28).
Ограничением метода является то, что с его помощью можно тестировать только известные мутации, затрагивающие сайты рестрикции. В зарубежных публикациях широко используется термин CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) – рестрикционный полиморфизм амплифицированных последовательностей. CAPS-маркеры считаются вторичными маркерами, так как праймеры для них создаются после выявления SNP на основе анализа нуклеотидной последовательности.
Визуализация продуктов ПЦР-ПДРФ реакции проводится методом гель-электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях.
Рис. 28. Пример ПЦР-ПДРФ анализа с последующим электрофорезом в ПААГ. Электрофореграмма, демонстрирующая генотипирование полиморфного варианта Ile50Val гена IL4Rα. Дорожки 1, 2, 7, 8 – генотип Ile/Ile; 4, 9 – генотип Ile/Val; 3, 5, 6 – генотип Val/Val