Лабораторная работа *Количественное определение пировиноградной кислоты в моче
Принцип метода. ПВК является промежуточным продуктом распада углеводов в организме. Она содержится во всех органах и тканях. Содержание ПВК в крови и моче возрастает при сахарном диабете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарно-адреналовой системы, токсикозах, при введении некоторых лекарственных средств, а также при недостаточности тиамина. Пировиноградная кислота, взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4 ДНФГ), в щелочной среде образует 2,4-динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты жёлто-оранжевого цвета, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации пировиноградной кислоты.
Реакция протекает по уравнению:
ПВК 2,4-ДНФ-гидразин 2,4-ДНФ-гидразин
пировиноградной кислоты
Ход определения.
№ |
Реактивы и этапы |
Опыт |
Контроль |
1 |
Моча,мл |
1 |
– |
2 |
Н2О |
– |
1 |
3 |
Спиртовой раствор КОН(2,5%-ный),мл |
1 |
1 |
4 |
Перемешивают в течение 1 мин |
|
|
5 |
2,4-ДНФГ(0,1%-ный раствор в 2 МHCl),мл |
0,5 |
0,5 |
6 |
Инкубируют 15 мин при комнатной температуре |
|
|
7 |
Фотометрируют против Н2О(λ=490нм, толщина кюветы 0,5 см). D490 |
|
|
8 |
Dоп–Dк |
|
|
Строят калибровочный график зависимости D490 от содержания ПВК по следующим данным
ПВК, мкг |
Dоп–Dк |
5 |
0,08 |
10 |
0,14 |
20 |
0,29 |
30 |
0,45 |
40 |
0,60 |
50 |
0,78 |
Расчёты. Содержание ПВК в суточной моче (на диурез 1500 мл) рассчитывают по формуле:
Для пересчета содержания ПВК (мг) в единицы количества вещества (мкмоль) надо умножить соответствующие величины на 11,4(коэффициент пересчета). Норма: 10-25 мг/сут, или 114-284 мкмоль/сут.
*Реакция организма на сахарную нагрузку
Принцип метода. У здорового человека однократный приём 50- 100г глюкозы вызывает временное повышение её содержания в крови - пищевую, или алиментарную, гипергликемию. Эта гипергликемия обусловлена тем, что при поступлении сразу большого количества глюкозы печень не успевает утилизировать её полностью и часть глюкозы поступает в кровь. Повышение содержания глюкозы в крови приводит к выделению инсулина, который нормализует её содержание в крови уже через 1.5-2ч. Обычно выделяется избыточное количество инсулина, и уровень глюкозы опускается даже ниже нормы. При инсулиновой недостаточности содержание глюкозы в крови после нагрузки достигает значительно больших величин и сохраняется значительно дольше.
Ход
определения.
Предварительно у взрослого пациента
берут кровь натощак. Затем он принимает
внутрь 75г глюкозы, растворённой в 250-300
мл воды. Через 30, 60, 90, 120 и 150 мин после
приёма глюкозы определяют её содержание
в крови и полученные результаты изображают
в виде кривой, где на абсциссе откладывают
время взятия крови в минутах, а на оси
координат - количество глюкозы, выраженное
в моль/л. Такие графики традиционно
называются «сахарными кривыми».
На основании приведенных ниже данных (см. таблицу) предлагается построить сахарные кривые, сравнить их между собой и сделать вывод об инсулиновом статусе пациентов А, Б и В. Согласно критериям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) концентрация глюкозы 7,8-10,0ммоль/л-1 в капиллярной крови через 2ч после нагрузки глюкозой свидетельствует о нарушении толерантности к глюкозе, а выше 11,1ммоль/ л-1 о сахарном диабете.
Время взятия крови после приёма глюкозы, мин |
Концентрация глюкозы, моль/л-1 |
||
Пациент А |
Пациент Б |
Пациент В |
|
0 |
5,9 |
4,5 |
8,0 |
30 |
7,0 |
7,0 |
11,5 |
60 |
9,2 |
7,5 |
11,8 |
90 |
9,0 |
5,5 |
11,5 |
120 |
8,0 |
5,5 |
11,0 |
150 |
7,0 |
5,0 |
11,0 |