2. Методы окраски отдельных групп про- и эукариот

Для окраски отдельных групп микроорганизмов используют специальные методы окраски: Романовского-Гимзы, Здродовского и др.

Метод Романовского-Гимзы. Относится к сложным, универсальным методам окраски Его применяют для обнаружения нуклеоида бактерий, а также окраски спирохет, хламидий, риккетсий, простейших и мазков крови. Этапы окраски:

1. На мазок нанести рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды), состоящего из смеси основного метиленового синего, азура и кислого эозина на 10-20 минут.

2. Препарат промыть и высушить.

ДНК нуклеоида окрашивается метиленовым синим и азуром в сине-фиолетовый цвет, цитоплазма клетки — эозином в розовый цвет. Представители разных родов спирохет окрашиваются в разные цвета по методу Романовского-Гимзы: боррелии — в сине-фиолетовый, трепонемы — бледно-розовый (T.pallidum — бледная трепонема), лептоспиры — красно-розовый.

Метод Здродовского используется для окраски риккетсий, являющихся облигатными внутриклеточными паразитами и вызывающими различные риккетсиозы. Этапы окраски:

1. Окрасить мазок разведенным фуксином Циля (10-15 капель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 минут, промыть водой

2. Обработать мазок 0,5% раствором лимонной кислоты или 0,01% раствором хлористоводородной кислоты, промыть водой.

3. Окрасить метиленовым синим в течение 1 минуты.

4. Промыть водой и высушить препарат.

Риккетсии, окрашенные по методу Здродовского, имеют красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют — голубая, ядра — синие.

3. Изучение подвижности микроорганизмов

Для изучения подвижности микроорганизмов используют нативные препараты, приготовленные по методу «висячей» и «раздавленной капли».

Метод «висячей капли». Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю исследуемого материала. Затем специальное предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют объектив малого увеличения (8х или 10х), находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х и исследуют препарат.

Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла.

4. Виды микроскопии

Иммерсионная микроскопия. Применяется для увеличения разрешающей способности метода световой микроскопии. Разрешающая способность системы светооптической микроскопии определяется длиной волны видимого света и числовой апертурой системы. Числовая апертура показывает величину угла максимального конуса света, попадающего в объектив, и зависит от оптических свойств (преломляющей способности) среды между объектом и линзой объектива. Погружение объектива в среду (минеральное масло), имеющую высокий коэффициент преломления, близкий к таковому у стекла, препятствует рассеиванию света от объекта. Таким образом, достигается увеличение числовой апертуры и соответственно разрешающей способности. Для иммерсионной микроскопии применяют специальные иммерсионные объективы, маркированные черной полосой и снабженные меткой (МИ — масляная иммерсия).

Фазово-контрастная микроскопия. Предназначена для изучения нативных (живых и неокрашенных) препаратов за счет повышения их контрастности. При прохождении света через окрашенные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные объекты — фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы. В оптической системе микроскопа применяют специальный конденсор с револьвером диафрагм и центрирующим устройством. Неокрашенные объекты выглядят темными на светлом поле (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Темнопольная микроскопия. Применяется для прижизненного изучения микробов в нативных неокрашенных препаратах. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при боковом освещении частиц, взвешенных в жидкости (эффект Тиндаля). Для этого используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. При этом способе освещения лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи. В результате на темном фоне (неосвещенном поле зрения) видны ярко светящиеся частицы (микроорганизмы). С помощью темнопольной микроскопии изучают препараты типа «раздавленная капля». Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные — 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц, поскольку эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия. Метод основан на явлении фотолюминесценции. Люминесценция (флюоресценция) — это способность некоторых объектов или веществ светиться при воздействии ультрафиолетового или другого коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра. Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или желтым. Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первичная люминесценция (биолюминесценция) наблюдается без предварительного окрашивания за счет собственных люминесцирующих веществ, вторичная — возникает после окрашивания флюорохромами (ауромин, корифосфин).

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: возможностью исследовать живые микробы и обнаруживать их в исследуемом материале в небольших концентрациях вследствие высокой степени контрастности. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченых флюоресцирующими красителями антител с антигенами изучаемого объекта.

Электронная микроскопия. Для построения изображения в электронной микроскопии используют поток электронов, что позволяет изучить объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа. В качестве «линз», фокусирующих электроны, служит электромагнитное поле, создаваемое электромагнитными катушками. Изображение в электронном микроскопе наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. Объекты при электронной микроскопии находятся в глубоком вакууме, поэтому подвергаются фиксации и специальной обработке. Кроме того, они должны быть очень тонкими, так как поток электронов сильно поглощается объектом. В связи с этим в качестве объектов используют ультратонкие срезы толщиной 20-50 нм, помещенные на тончайшие пленки. Разрешающая способность электронных микроскопов значительно выше, чем световых, и достигает 15 нм, что позволяет получить полезное увеличение в миллионы раз.

Наиболее широко используются два способа электронной микроскопии: просвечивающая (трансмиссивная) и сканирующая. Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме и др. Сканирующая электронная микроскопия применяется для получения трехмерного изображения поверхности исследуемого объекта.

Таблица 6. Микроскопическое изучение микроорганизмов

Вид микроскопии	Видоизменения оптической системы	Способы приготовления препарата	Назначение метода
Световая микроскопия	Поднятый конденсор, открытая диафрагма	Фиксированные и окрашенные мазки	Изучение морфологических и тинкториальных свойств
Темнопольная микроскопия	Конденсор темного поля	«Висячая» или «раздавленная» капля	Изучение подвижности, анатомических структур
Фазово-контрастная микроскопия	Фазово-контрастное устройство	«Висячая» или «раздавленная» капля	Определение подвижности, анатомических структур
Люминесцентная микроскопия	Источник УФ-лучей, система светофильтров	Окрашен флюорохромом	Индикация в исследуемом материале
Электронная микроскопия	Поток электронов в глубоком вакууме, электромагнитное поле	Напыление металлами	Изучение ультраструктуры вирусов и бактерий