III. План практической работы

1. Учесть и зарисовать демонстрацию опыта определения фаголизабельности методом стекающей капли (метод Отто) — качественный метод определения фагочувствительности бактерий.

Постановка. Готовят 2 миллиардную взвесь из исследуемой и заведомо фагочувствительной культуры бактерий и наливают по 1 мл в чашки с хорошо подсушенным мясо-пептонным агаром. Осторожно покачиванием чашек взвесь равномерно распределяют по поверхности агара, избыток отсасывают пастеровской пипеткой, посевы подсушивают в термостате и фаг наносят пастеровской пипеткой в виде стекающих капель, затем чашки со слегка приоткрытыми крышками снова помещают в термостат для подсушивания, после чего поворачивают их вверх дном. Инкубация при температуре 37ºC в течение 18-20 часов.

Учет. Результаты учитывают по наличию «стерильных» зон на месте стекания капли фага. Обширная зона лизиса культуры свидетельствует о специфическом действии фага на данную бактериальную культуру.

2. Учесть и зарисовать демонстрацию опыта определения титра бактериофага по методу Грация (количественный метод)

Постановка. Чашки с 25-30 мл 1,5% МПА тщательно высушивают и оставляют до следующего дня при комнатной температуре. Для выделения фага фильтрат разводят бульоном (1:10, 1:100, 1:1000) и в пробирку, содержащую 2,5 мл расплавленного 0,7% агара, вносят 1 мл фильтрата того или иного разведения и 0,1 мл известной чувствительной к фагу культуры бактерий. Содержимое пробирки быстро смешивают и выливают в чашки на подсушенную поверхность агара. Чашки оставляют на 30 мин. при комнатной температуре, затем помещают в термостат при 37ºC на сутки.

Учет. При наличии даже единичных корпускул фага он обнаруживается в виде отдельных негативных колоний на фоне роста культуры бактерий в виде помутнения среды, при большой концентрации — в виде сплошного лизиса бактерий. Активность (титр фага) выражают максимальным разведением, в котором проявляется литическое действие. Титр фага определяют путем подсчитывания количества негативных колоний и умножают на разведение.

Например, при исследовании по методу Грация в 1 мл фага в разведении 10^-7 на чашке было обнаружено 25 колоний, следовательно, титр фага (количество корпускул в 1 мл) равен 25 ·10^{7 —} 2,5 ·10⁸ ­.

3. Учесть и зарисовать опыт определения фагогруппы и фаготипа стафилококка.

Цель: установить связь между отдельными случаями заболевания, выявление источника инфекции, а также путей ее распространения.

Постановка. Суточную бульонную культуру стафилококка засевают на поверхность питательного агара методом газона. Избыток культуры удаляют и подсушивают 30-40 мин. при 37ºC. Дно засеянной чашки расчерчивают в соответствии с количеством используемых фагов (одну для определения фагогруппы, вторую — фаготипа) и в каждую часть засеянной среды в определенном порядке наносят каплю соответствующего фага. После подсыхания капель фагов чашку переворачивают и инкубируют 18-20 часов при 37ºC.

Учет. «+» результат оценивают по наличию зон лизиса в определенных квадратах на фоне сплошного роста бактерий.

Например, исследуемая культура стафилококка относится к III фагогруппе, 47 фаготипу.