4. Морфология и ультраструктура бактериальной клетки

Один из основных признаков прокариотической клетки — отсутствие внутреннего разделения, обеспечиваемого элементарными мембранами. По сути, единственная мембранная система прокариот — ЦПМ, входящая в состав клеточной стенки, часто сложно устроенная и проникающая поперечными складками глубоко в цитоплазму.

Структура бактерий хорошо изучена с помощью электронной микроскопии целых клеток и их ультратонких срезов, а также других методов. Бактериальную клетку окружает оболочка, состоящая из клеточной стенки и цитоплазматической мембраны. Под оболочкой находится протоплазма, состоящая из цитоплазмы с рибосомами и неоформленного ядра, называемого нуклеоидом. Могут быть дополнительные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили, включения. Некоторые бактерии способны образовывать споры для переживания неблагоприятных условий. Все структурные элементы бактериальной клетки условно можно разделить на обязательные (нуклеоид, ЦПМ, клеточная стенка, цитоплазма, 70S рибосомы) и необязательные, которые могут отсутствовать у некоторых видов (капсула, плазмиды, включения, жгутики, пили и др.)

Рибосомы

Нуклеоид

Цитоплазматичекие включения

Цитоплазма

Капсула

Ворсинки (пили) Мезосома

Жгутик

Клеточная

стенка

Цитоплазматическая

мембрана

Рис. 1. Строение прокариотической клетки

Капсула. Клеточную оболочку многих бактерий окружает слой аморфного, гидрофильного вещества. Капсула состоит из полисахаридов (экзополисахаридов), иногда из полипептидов; например, капсула B.anthracis состоит из полимеров D-глутаминовой кислоты. Основную роль в организации капсул играет ЦПМ. Выделяют микрокапсулы (выявляемые только при электронной микроскопии в виде слоя мукополисахаридных фибрилл) и макрокапсулы (обнаруживают при световой микроскопии). У некоторых бактерий полимеры клеточной оболочки, выделяемые наружу, свободно располагаются вокруг нее, образуя слизистый слой. Слизь растворима в воде. Мукоидные экзополисахариды характерны для мукоидных штаммов синегнойной палочки, часто встречающихся в мокроте больных с кистозным фиброзом. Капсула и слизь предохраняют бактерии от повреждений, высыхания, фагоцитов, воздействия бактерицидных факторов, обеспечивают адгезию на различных субстратах, могут содержать запасы питательных веществ. Капсула антигенна (К-антиген). Для визуализации капсулы используют негативные методы окраски (по Бурри-Гинсу).

Клеточная стенка. Клеточная стенка является уникальной, по своему химическому составу, структурой прокариотической клетки. Она выполняет ряд важных функций: защищает бактерии от внешних воздействий, придает им характерную форму, поддерживает постоянство внутренней среды, участвует в делении, на поверхности клеточной стенки находятся рецепторы для бактериофагов, бактериоцинов и различных химических веществ, через клеточную стенку осуществляется транспорт питательных веществ и выделение метаболитов. Это прочная, упругая структура, имеющая сложное строение. Опорным каркасом клеточной стенки бактерий является пептидогликан (муреин, мукопептид) — гетерополимер, состоящий из повторяющихся дисахаридных групп, соединенных поперечными и боковыми цепочками. Дисахарид, являющийся структурной единицей пептидогликана, состоит из N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных β-гликозидными связями. К молекуле N-ацетилмурамовой кислоты присоединяются олигопептиды, образующие боковые цепочки. Связывание фрагментов пептидогликана заключается в образовании пептидной связи между терминальным остатком аминокислотного мостика (D-аланином) с предпоследним остатком примыкающего аминокислотного мостика (L-лизином или диаминопимелиновой кислотой). Боковые мостики образуют четыре аминокислоты, поперечные (вертикально связывающие слои пептидогликана) — пять аминокислот. В состав боковых и поперечных мостиков входят уникальные аминокислоты, присутствующие только у прокариот, что делает эти связи мишенью для ряда антибактериальных препаратов.

По строению и составу клеточной стенки микроорганизмы делятся на грамположительные и грамотрицательные, что является важным признаком, положенным в основу искусственной систематики микробов. Основным компонентом толстой клеточной стенки грамположительных бактерий является многослойный пептидогликан, составляющий 40-90 % массы клеточной стенки. С пептидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые кислоты (от греч. teichos — стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола и рибитола, соединенных фосфатными мостиками, соответственно глицеринтейхоевые и рибитейхоевые кислоты.

Пептидогликан

Цитоплазмамическая

мембрана

Периплазматическое

пространство

Наружная мембрана

О-специфическая цепь

Ядро ЛПС

Липид А

ЛПС

Грамположительные бактерии Грамотрицательные бактерии

Рис. 2. Строение клеточной стенки бактерий

Клеточная стенка каждого вида содержит только один тип тейхоевых кислот (за исключением вида Streptomyces). Тейхоевые кислоты являются основными поверхностными антигенами большинства бактерий. У большей части грамположительных бактерий также имеются периплазматические тейхоевые кислоты, располагающиеся между клеточной стенкой и ЦПМ, и являющиеся группоспецифическими антигенами. В клеточной стенке грамположительных бактерий содержится небольшое количество полисахаридов, липидов, белков. Содержание белков вариабельно для различных бактерий. Для некоторых бактерий, например, стрептококков группы А, белки являются серовароспецифичными Аг.

В состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий входит наружная мембрана, связанная посредством липопротеина с подлежащим слоем пептидогликана. На ультратонких срезах бактерий наружная мембрана имеет вид волнообразной трехслойной структуры, сходной с внутренней мембраной, которую называют цитоплазматической. Основным компонентом этих мембран является бимолекулярный (двойной) слой липидов. Внутренний слой наружной мембраны представлен фосфолипидами, а в наружном слое расположен липополисахарид. Липополисахарид наружной мембраны состоит из 3 фрагментов: липида А — консервативной структуры, практически одинаковой у грамотрицательных бактерий; ядра, или стержневой, коровой части (от лат. core — ядро), относительно консервативной олигосахаридной структуры (наиболее постоянной частью ядра ЛПС является кетодезоксиоктоновая кислота); высоковариабельной О-специфической цепи полисахарида, образованной повторяющимися идентичными олигосахаридными последовательностями (О-антиген). Белки матрикса наружной мембраны пронизывают ее таким образом, что молекулы белка, называемые поринами, окаймляют гидрофильные поры, через которые проходят вода и мелкие гидрофильные молекулы.

При нарушении синтеза клеточной стенки бактерий под влиянием различных факторов образуются клетки с измененной формой (чаще шаровидной): протопласты — бактерии, полностью лишенные клеточной стенки; сферопласты — бактерии с частично сохранившейся клеточной стенкой. Бактерии сферо- или протопластного типа, утратившие способность к синтезу пептидогликана и способные размножаться, называются L-формами. Существуют нестабильные L-формы, которые могут реверсировать, «возвращаясь» в исходную бактериальную клетку, и стабильные L-формы, не способные к реверсии.

Цитоплазматическая мембрана. ЦПМ — это обязательная клеточная структура, являющаяся физическим, осмотическим, метаболическим барьером между внутренним содержимым бактериальной клетки и внешней средой. ЦПМ состоит из двух слоев фосфолипидов и встроенных в липидную мембрану белковых молекул (как большинство биологических мембран). Белки составляют 20-75%, липиды — 25-40% и в незначительных количествах в ЦПМ присутствуют углеводы и РНК. Белки ЦПМ подразделяются на структурные и функциональные. Первые образуют различные структуры ЦПМ, вторые представлены ферментами, участвующими в синтетических реакциях на поверхности мембраны и окислительно-восстановительных процессах, а также некоторыми специализированными энзимами (пермеазы участвуют в транспорте веществ). При избыточном росте (по сравнению с ростом клеточной стенки) цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты — впячивания в виде сложно закрученных мембранных структур, называемые мезосомами. Мезосомы образуют поперечные перегородки между делящимися клетками и являются местом прикрепления бактериальной хромосомы.

У некоторых бактерий между ЦПМ и клеточной стенкой располагается периплазматическое пространство — полость шириной около 10 нм. Снаружи в это пространство открываются поры клеточной стенки, изнутри выходят некоторые клеточные ферменты (рибонуклеазы, фосфатазы, β-лактамазы).

Цитоплазма. Цитоплазма бактерий представляет собой коллоидный матрикс, служащий для реализации жизненно важных функций. Цитоплазма большинства бактерий содержит ДНК, рибосомы и запасные гранулы; остальное пространство занимает коллоидная фаза. Ее основные составляющие — растворимые ферменты и РНК (мРНК и тРНК).

Бактериальный геном. Эквивалентом ядра у бактерий является нуклеоид (генофор). Он расположен в центральной зоне бактерий в виде двойной суперспирализованной кольцевой молекулы ДНК. Она составляет 2-3% сухой массы клетки (более 10% по объему). Генофор не содержит гистонов. Объем генетической информации, кодируемой в бактериальной хромосоме зависит от вида бактерии. Кроме нуклеоида в бактериальной клетке имеются внехромосомные носители генетической информации — плазмиды, являющиеся ковалентно замкнутыми кольцами ДНК. Плазмиды несут ряд различных генов, кодирующих дополнительные (необязательные) признаки бактерий, например, гены антибиотикорезистентности (R-фактор). Бактерии могут обмениваться плазмидами в процессе конъюгации.

Рибосомы. Бактериальные рибосомы — сложные глобулярные образования, состоящие из молекул РНК и связанных с ними белками. Рибосомы необходимы для синтеза полипептидов. Количество рибосом в различных бактериальных клетках колеблется от 5 до 50 тысяч. Диаметр рибосом составляет около 16-20 нм. Скорость их осаждения при ультрацентрифугировании составляет 70S (единиц Сведберга), тогда как у эукариотических клеток 80S. Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц с коэффициентом седиментации 50S и 30S (у эукариот 40S и 60S). Объединение субъединиц происходит перед началом трансляции. Рибосомальные РНК (рРНК) — консервативные элементы бактерий («молекулярные часы» эволюции). 16S рРНК входит в состав малой субьединицы рибосом, а 23S рРНК — в состав большой субъединицы рибосом. Изучение 16S рРНК является основой геносистематики, позволяющей оценить степень родства организмов. Различия в строении рибосом про- и эукариотических клеток делают рибосомы эукариот практически резистентными к действию антибиотиков, блокирующих синтез белка у бактерий.

Запасные гранулы. В цитоплазме бактерий содержатся различные включения, которые содержат временный избыток метаболитов. В виде гранул могут запасаться полисахариды (крахмал, гликоген), жиры (триглицериды, запасаются у дрожжеподобных грибов рода Candida), полимеры β-оксимасляной кислоты, полифосфаты (волютин) у C.diphtheriae, сера, кристаллизованные белки и др.

Жгутики. Жгутики бактерий являются органами движения (локомоции) бактерий. Расположение жгутиков — характерный признак, имеющий таксономическое значение. По количеству и расположению жгутиков различают монотрихи — один жгутик (V.cholerae), перитрихи (от греч. peri — вокруг и trichos — волос) — жгутики по всей поверхности бактериальной клетки (E.coli), лофотрихи (от греч. lophos — пучок и trichos — волос)– пучок жгутиков на одном конце клетки (Pseudomonas), амфитрихи (от греч. amphi — двойной, двусторонний и trichos — волос) –единичные жгутики или пучки жгутиков на разных полюсах клетки (Spirillum). Жгутик — спирально изогнутая полая нить, образованная субъединицами белка флагеллина. Толщина жгутиков 12-20 нм, длина 3-15 мкм (больше длины клетки). Жгутики состоят из 3 частей: спиралевидной нити, крюка и базального тельца. Базальное тельце содержит стержень со специальными дисками: одна пара дисков — у грамположительных и 2 пары дисков — у грамотрицательных бактерий. Дисками жгутики прикреплены к цитоплазматической мембране и клеточной стенке. При этом создается эффект электромотора со стержнем-мотором, вращающим жгутик. Бактериальные жгутики совершают поступательные и вращательные движения, проталкивая бактерии через среду подобно корабельному винту. Жгутики являются H-антигенами, что используется в серологической идентификации.

Подвижность бактерий определяют микроскопией препаратов «раздавленной» или «висячей» капли. Способность к движению можно определять также после внесения культуры бактерий уколом в столбик полужидкого агара (подвижные виды растут по всей толще среды, неподвижные — по уколу) или посевом бактерий в водный конденсат скошенного столбика агара (подвижные виды переплывают из конденсата на поверхность среды и колонизируют ее).

Микроворсинки. Помимо жгутиков, поверхность многих бактерий покрыта цитоплазматическими выростами — микроворсинками, встречающимися у подвижных и неподвижных видов. Пили (фимбрии, ворсинки) — нитевидные образования, более тонкие и короткие (3-10 нм х 0,3-10 мкм), чем жгутики. Пили отходят от поверхности клетки и состоят из белка пилина, обладающего антигенной активностью. Различают пили, ответственные за адгезию, прикрепление бактерий к поражаемой клетке; пили, ответственные за питание, водно-солевой обмен и половые (F-пили), или коньюгационные, пили. Пили многочисленны — несколько сотен на клетку. Однако половых пилей обычно бывает 1-3 на клетку: они образуются так называемыми «мужскими» клетками-донорами, содержащими трансмиссивные плазмиды (F-, R-, Col- плазмиды). Отличительной особенностью половых пилей является взаимодействие с особыми «мужскими» сферическими бактериофагами, которые интенсивно адсорбируются на половых пилях.

Споры. Споры образуются при неблагоприятных условиях существования бактерий (высушивание, дефицит питательных веществ и др.). Внутри бактериальной клетки образуется одна спора (эндоспора). Образование спор способствует сохранению вида и не является способом размножения, как у грибов. Способностью к спорообразованию обладают только бактерии родов Bacillus и Clostridium, включающие патогенные для человека виды, и многие сапрофиты. У бактерий рода Bacillus диаметр споры не превышает диаметр (поперечник) бактериальной клетки. У бактерий рода Clostridium (от лат. closter, веретено) диаметр споры превышает поперечник бактерии, что придает им форму веретена (C.perfringens), барабанной палочки (C.tetani) или теннисной ракетки (C.botulinum) при центральной, терминальной и субтерминальной локализации спор соответственно. Основное значение спор в выживаемости бактерий определяет их терморезистентность и резистентность к другим факторам (дезинфектанты и др.), оказывающим губительное воздействие на бактерии. Высокая устойчивость спор связана с низким содержанием свободной воды, высокой концентрацией кальция, вялостью метаболических процессов, наличием дипиколиновой кислоты и белка, богатого цистеином (что делает его похожим на кератин), а также наличие нескольких оболочек, которые являются дополнительной защитой от неблагоприятных внешних воздействий. При попадании спор в благоприятные условия они прорастают, проходя три последовательные стадии: активацию, инициацию, вырастание. Споры плохо окрашиваются и остаются бесцветными в окрашенных клетках при использовании обычных методов окраски (простые методы, метод Грама). Для окраски спор используют метод Ожешко (Ауэски). Споры окрашиваются в красный цвет.