III. План практической работы

1. Изучить и записать методику заражения клеточной культуры вирусом полиомиелита.

Материал для исследования: смывы из зева (первые дни болезни), фекалии.

Вирусологическое исследование. Выделение энтеровирусов из исследуемого материала осуществляют путем заражения клеточных культур. Для уничтожения сопутствующей бактериальной микрофлоры нестерильный материал (испражнения, глоточные смывы) предварительно обрабатывают антибиотиками (смесь пенициллина со стрептомицином, содержащая по 1000 ЕД/мл каждого антибиотика в среде 199) в течение суток при 4ºC, после чего производят контрольный посев на стерильность. При сохранении бактериальной флоры материал повторно обрабатывают теми же антибиотиками. Затем одновременно заражают по 2-3 пробирки с первичной (эмбриональные фибробласты человека или клетки почек обезьян) и перевиваемой культурой клеток (HeLa, амниона человека и др.), поскольку одни серотипы энтеровирусов лучше репродуцируются в первичных, другие — в перевиваемых клетках. Индикацию вирусов проводят по ЦПД на 2-3 день инкубации при 35 ºC.

2. Учесть и зарисовать цпд в клеточных культурах

Мазок №1- нормальная культура клеток. В поле зрения наблюдаются клетки с ярко выраженной цитоплазматической мембраной, цитоплазмой и находящимся в ней ядром. Клетки с неизмененной внутренней структурой равномерно распределены в мазке.

Мазок №2- цитопатическое действие вируса на клетки. В поле зрения наблюдается полная или частичная дегенерация клеток (разрыв монослоя) за счет внутриклеточной репродукции вируса, что проявляется в уменьшении количества клеток, а также изменении формы клеток, и формировании гигантских многоядерных клеток (симпластов).

1. Учесть и зарисовать реакцию гемадсорбции

Целый ряд вирусов (гриппа, парагриппа и др.) обладают гемадсорбирующими свойствами, что позволяет использовать реакцию гемадсорбции для индикации этих вирусов даже при отсутствии выраженного ЦПД в культуре клеток.

Дать определение гемадсорбции и используя таблицу, зарисовать эритроциты, адсорбированные на зараженных вирусом клетках.

3. Учесть и зарисовать реакцию образования бляшек под агаром

Культуру клеток с питательной средой №199 и агаром заражают вирусологическим материалом и инкубируют в течение нескольких суток при температуре 37ºC. Появление светлых пятен («бляшка»), видимых невооруженным глазом, на фоне окрашенного монослоя живых клеток свидетельствует о разрушенных вирусами клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает распространение вирусов по всему монослою после выхода их из разрушенной клетки и обеспечивает взаимодействие вирусов только с соседними клетками. Каждая «бляшка» образуется потомством одного вириона. Подсчитав количество «бляшек», можно определить концентрацию вирусов в исследуемом материале. Кроме того, «бляшки» разных групп вирусов отличаются по размеру, форме, срокам появления.

Используя таблицу, зарисовать реакцию образования бляшек под агаром.

5. Учесть и зарисовать реакцию подавления метаболической активности (цветная проба)

Представлены 3 пробирки: 1-я — рабочая, 2-я- контроль культуры клеток и 3-я- контроль среды №199

	1-я пробирка	2-я пробирка	3-я пробирка
Компоненты:	Культура клеток, питательная среда № 199, вирусологический материал	Культура клеток, питательная среда № 199	питательная среда № 199
pH/цвет	Нейтральная/красный	Кислая/желтый	Нейтральная/красный
ЦПД	+	-	-