6. Типы тканевых культур
Первичные (трипсинизированные) культуры — фибробласты эмбриона курицы (ФЭК), человека (ФЭЧ), клетки почки различных животных. Их получают из клеток различных тканей путем размельчения и трипсинизации. Используют однократно, т.е. постоянно необходимо иметь соответствующие органы или ткани.
2. Линии диплоидных клеток (полуперевиваемые) пригодны к повторному диспергированию и росту, как правило, не более 40-50 пассажей (теряют исходные свойства). Их обычно получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, не претерпевают злокачественной трансформации, но имеют ограниченную продолжительность жизни. Так, например, пользуется известностью штамм ДКЛЧ (диплоидные клетки лёгких человека), штаммы WJT-38, JMR-90, MRC-5 из лёгких ткани эмбриона человека.
3. Перевиваемые линии (гетероплоидные культуры), адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, способны к многократному диспергированию и перевиванию, т.е. к многократным пассажам. Наиболее удобны в вирусологической работе — линии опухолевых клеток Hela (рак шейки матки), Hep (рак гортани).
Питательные среды, используемые для выращивания культур клеток: среда 199, среда Игла и др.
7. Методы индикации вирусов
Индикация вирусов — обнаружение факта их репродукции, основана на выявлении различных биологических свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками.
Индикацию вирусов проводят на основе следующих феноменов: ЦПД вирусов, образования внутриклеточных включений, образования бляшек, реакции гемагглютинации, гемадсорбции, «цветной» реакции (табл.39).
Таблица 39. Методы индикации вирусов
ЦПД (цитопатическое действие) — видимые под микроскопом морфологические изменения клеток (вплоть до их отторжения от стекла), возникающие в результате внутриклеточной репродукции вирусов. ЦПД вируса в культуре клеток можно выявить микроскопией в сроки от 3-5 суток после заражения и до 1 месяца. |
|
||||
Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выявляемые под микроскопом при специальном окрашивании. Вирус натуральной оспы образует цитоплазматические включения — тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы — внутриядерные включения. |
|
||||
Бляшки, или “негативные” колонии — ограниченные участки разрушенных вирусами клеток, культивируемых на питательной среде под агаровым покрытием, видимые как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Один вирион образует потомство в виде одной бляшки. “Негативные” колонии разных вирусов отличаются по размеру, форме, поэтому метод бляшек используют для дифференциации вирусов, а также для определения их концентрации (качественно-количественный). |
|
||||
РГА (реакция гемагглютинации) основана на способности некоторых вирусов вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов за счет вирусных гликопротеиновых шипов — гемагглютининов. Проводится в течение 2-х часов. |
|
||||
Реакция гемадсорбции — способность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты за счет включения в их оболочку гемагглютинина вируса. |
|
||||
“Цветная” реакция оценивается по изменению цвета индикатора, находящегося в питательной среде культивирования. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе метаболизма выделяют кислые продукты, что ведет к изменению рН среды и соответственно цвета индикатора смалинового на желтый. При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет свой первоначальный малиновый цвет. |
|||||
