Граф логічної структури мікробіологічного дослідження гепатитів

Матеріал для дослідження: сироватка крові, випорожнення.

Виявлення вірусів – імунна електронна мікроскопія

Виявлення антигенів вірусів – ІФА, РІА.

Виявлення антитіл – РНГА, ІФА, РІА.

Виявлення генетичного матеріалу вірусів – ЛПР.

6. Практичні роботи, які виконують на занятті.

   1. Ознайомитись з принципом постановки ІФА з метою виявлення специфічних антигенів в сироватці крові хворого. На занятті в якості твердофазного носія використовують планшети з адсорбованими на дні луночок антитілами. В лунки вносять по 1 краплині досліджуваної сироватки і вміщують планшети в термостат при t 37 ⁰C. Промивають луночки буферним розчином і вносять мічені ферментом (пероксидазою хрону) антитіла проти цього антигену (прямий варіант). Планшети вміщують в термостат при t 37 ⁰C. Промивають луночки буферним розчином, вносять по 1 краплині перекису водню та ортофенілдіаміну (ОФД). Планшети вміщують в термостат до появи жовтого забарвлення в луночці з контролем. Кількість приєднаного до твердої фази ензиму відповідає кількості антигенів. При наявності в досліджуваній сироватці антигенів вірусу в лунках змінюється колір рідини на жовтий або жовтувато-коричневий (результат позитивний). В лунках з сироваткою, яка не містить антигенів вірусів, колір рідини не змінюється (результат негативний). Замалювати схему реакції.

   2. Познайомитись із принципом постановки реакції гібридизації нуклеїнових кислот. Метою методу є виявлення в досліджуваному матеріалі ділянок ДНК, характерних для даного збудника. Для цього використовують їх гібридизацію з діагностичними ДНК-зондами. ДНК-зонди – це однониткові фрагменти ДНК (комплементарні до специфічних ділянок ДНК збудника), мічені радіонуклідами, ферментами або флуорохромами. Схему реакції замалювати.

   3. Провести облік результатів реакції зв’язування комплементу, поставлену із сироваткою хворого на гепатит А.

Для постановки РЗК в пробірках готують послідовні розведення сироватки пацієнта (1:5 – 1:160). Потім додають відтитрований антиген та комплемент в робочих дозах. Дослід супроводжують 2 контролями: сироватки (фізіологічний розчин, сироватка, комплемент) та антигену (фізіологічний розчин, антиген, комплемент). Одночасно готують індикаторну систему (інактивована гемолітична сироватка кролика та 3 % завис еритроцитів барана у фізіологічному розчині). Обидві системи витримують в термостаті 40 хв., після чого до основного досліду та контролів додають гемолітичну систему. Повторно витримують реакцію в термостаті до появи гемолізу в контролях. РЗК вважають позитивною при затримці гемолізу в дослідних пробірках не менш як на «++». Титр антитіл визначають за найбільшим розведенням сироватки, при якому реєструють позитивну РЗК.

4. Провести облік результатів реакції пасивної гемаглютинації, поставлену з парними сироватками хворого хронічним гепатитом В та еритроцитами, навантаженими HBsAg.

У луночках планшети готують розведення сироватки хворого (в об'ємі 0,5 мл): 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 до якого додають по 1 мл завису еритроцитарного діагностикуму. Для контролю № 1 використовують завис еритроцитів, не оброблених антигеном, а для контролю № 2 – завис діагностикуму з нормальною сироваткою. Реакція відбувається при кімнатній температурі протягом 30-45 хвилин. У деяких луночках планшету еритроцитарний антиген аглютинуэться антитілами сироватки пацієнта, тобто, реєструють наявність осаду еритроцитів із нерівними краями («парасольки»). Такий результат вважають позитивним. В контролях спостерігають неаглютиновані еритроцити, які і осідають у центрі лунки щільним скупченням з рівними краями («ґудзики») - реакція негативна. Титр сироватки – це найбільше її розведення, при якому відбулась аглютинація еритроцитарного діагностикуму (остання лунка з «парасолькою»). Діагностичне значення має наростання тиру антитіл у другій сироватці більш, ніж у 4 рази в порівнянні з першою сироваткою.

5. Записати препарати для профілактики гепатитів А та В і план щеплень проти гепатиту В.

1. Гамма-глобулін проти гепатиту А.

2. Жива атенуйована вакцина проти гепатиту А.

3. Культуральна інактивована моновакцина вакцина проти гепатиту А.

4. Гамма-глобулін проти гепатиту В.

5. Плазмова вакцина для профілактики гепатиту В.

6. Рекомбінантна вакцина проти гепатиту В містить очищений HBsAg, одержаний за допомогою генно-інженерної біотехнології.

7. Комбіновані вакцини проти гепатиту А та В; проти дифтерії, кашлюку, правцю та гепатиту В.

Щеплення проти гепатиту В за віком проводять за схемою: перші 10 годин життя, 3 місяці, 5 місяців.

7. Рекомендована література.

7.1. Література основна.

Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія : підручник для студ. вищ. мед. навч. заклад / За редакцією В.П.Широбокова. – Вінниця : Нова Книга, 2011. – 605-632.

К.Д.Пяткін, Ю.С.Кривошеїн. Мікробіологія, К., 1982. – С. 348-351, 367-369.

С.І.Климнюк та співавт. Практична мікробіологія. Тернопіль, 2004. – С. 369-375.

7.2. Література додаткова.

Мікробіологія, вірусологія, імунологія, інфекційні хвороби. Словник/ За ред. Г.К.Палія, В.Г.Палія. – Київ: Здоров'я, 2004. – С. 32, 39.

І.С. Гайдаш, В.В. Флегонтова. Медична вірологія. Луганськ, 2002. – С. 296-298, 188-194, 327-329, 341-345.

8. Матеріали для самоконтролю.

1) У школі зареєстровано випадок захворювання гепатитом А. Який препарат необхідно застосувати для специфічної профілактики дітям, які перебували в контакті з хворим однокласником?

A Інтерферон

B Жива вакцина

C Інактивована вакцина

D Імуноглобулін

E Рибовірин

2) При проведенні лабораторної діагностики вірусного гепатиту В лаборантом по необережності розбита пробірка з кров'ю хворого і уламком скла розітнута шкіра на руці. Який препарат необхідно ввести лаборанту для екстреної профілактики гепатиту?

A Рекомбінантна вакцина

B Убита вакцина

C Специфічний імуноглобулін

D Хімічна вакцина

E Жива вакцина

3) Останніми роками відмічено збільшення захворюваності гепатитом В. З метою створення активного імунітету проводять вакцинацію населення. Який препарат для цього використовують?

A Анатоксин

B Живу вакцину

C Інактивовану вакцину

D Специфічний імуноглобулін

E Рекомбінантну вакцину

4) З метою перевірки крові донорів на наявність антигенів гепатиту В необхідно застосувати високочутливі методи. Яку з названих реакцій слід застосувати з вказаною метою?

A Твердофазний імуноферментний аналіз

B Імуноелектрофорез

C Непрямої гемаглютинації

D Зв’язування комплементу

E Непрямої імунофлуоресценції

5) Студенту заборонено бути донором, бо у нього виявлено маркер, що вказує на інфікованість одним із вірусів гепатиту. Який маркер був виявлений?

A НВs-АТ

B НВs-АГ

C НВс - АГ

D НВс-АТ

E НВе - АГ

Ситуаційна задача 1. До лікаря звернулась жінка зі скаргами на слабість, головний біль, нудоту, тяжкість в епігастральній ділянці, блювоту, відсутність апетиту, високу температуру (38 ⁰С), темне забарвлення сечі. Вважає себе хворою четвертий день. З анамнезу відомо, що вона працює на овочевому базарі продавцем фруктів. За останні півроку парентеральних втручань, відвідувань стоматолога, гінеколога не було. Заміжня. Позашлюбні відносини заперечує. Раніше не хворіла гепатитом. Жінку госпіталізували з попереднім діагнозом «Гострий вірусний гепатит А».

Завдання.

1. Вкажіть таксономічне положення та опишіть будову віріону гепатиту А.

2. Як могла заразитись пацієнтка? Які дані анамнезу вказують на гепатит А і виключають інші вірусні гепатити?

3. Охарактеризуйте післяінфекційний імунітет.

4. Вкажіть клінічний матеріал, назвіть мету та методи лабораторної діагностики гепатиту А.

5. Назвіть біологічні препарати для специфічної профілактики гепатиту А.

Ситуаційна задача 2. В інфекційну клініку був направлений молодий чоловік із симптомами гепатиту. Хворий скаржиться на слабість, швидку втому, відсутність апетиту. За останні дні у нього підвищилась температура до 37,8 ⁰С, сеча набула темного кольору, а випорожнення стали безбарвними. При обстеженні лікар відзначив біль в епігастральній ділянці, ущільнення печінки та її болючість. Із анамнезу відомо, що хворий декілька місяців тому мав інтимні стосунки з жінкою, яка через деякий час захворіла гепатитом В. Лікар поставив хворому попередній діагноз «Вірусний гепатит В, гострий період захворювання».

Завдання.

1. Вкажіть таксономічне положення вірусу гепатиту В (HBV) та опишіть будову віріону.

2. Назвіть антигени HBV та їх локалізацію.

3. Охарактеризуйте стійкість HBV у зовнішньому середовищі, джерела та шляхи передачі збудника. Як міг заразитися хворий?

4. Поясніть патогенез вірусного гепатиту В та роль окремих ланок імунного захисту в його розвитку.

5. Охарактеризуйте препарати, які використовують для активної та пасивної профілактики гепатиту В.

Автор

Доцент А.В.Крижановська