Тема: гликопротеины и протеогликаны Установление гликопротеиновой природы яичного альбумина Получение препарата яичного альбумина

1. Отделяют белок куриного яйца от желтка (считается, что масса белка в одном яйце в среднем равна 30 г, а общая концентрация белка составляет 10%). Отделенную белковую часть хорошо взбивают.

2. Белок переносят в мерный цилиндр и добавляют к нему девятикратный объем дистиллированной воды.

3. Полученный раствор тщательно перемешивают и фильтруют через двойной слой смоченной водой марли, помещенной в воронку. При этом в осадке остается часть не растворившегося яичного глобулина.

4. Для полного удаления яичного глобулина из раствора овальбумина к 40 мл фильтрата приливают такой же объем насыщенного раствора сульфата аммония.

5. Выпавший осадок яичного глобулина отфильтровывают и получают ~0,5% раствор яичного альбумина (средняя концентрация альбумина в белке куриного яйца составляет около 6%).

Доказательство наличия углеводного фрагмента в яичном альбумине

1. В две пробирки приливают по 4 мл полученного раствора яичного альбумина.

2. В одну из них добавляют 0,5 мл 0,1% раствора -нафтола, а в другую – 0,5 мл 1% раствора тимола, и содержимое каждой пробирки хорошо перемешивают.

3. В обе пробирки осторожно по стенке наслаивают по 1 мл концентрированной серной кислоты.

4. Через некоторое время наблюдают появление окрашенных колец на границе растворов и делают выводы.

Тема: методы количественного определения углеводов Определение концентрации глюкозы в крови орто-толуидиновым методом

1. В пробирку сначала вносят 0,9 мл 3% раствора ТХУ и затем добавляют 0,1мл сыворотки крови.

2. Смесь взбалтывают и для удаления осадка белка центрифугируют при 8000g в течение 5 мин.

3. К 0,5 мл супернатанта добавляют 4,5 мл о-толуидинового реактива.

4. Пробирку со смесью помещают в кипящую водяную баню на 8 мин., после чего содержимое пробирки охлаждают.

5. Оптическую плотность раствора определяют при длине волны 590 нм против холостой пробы (дистиллированная вода).

6. Концентрацию глюкозы (в ммоль/л) в сыворотке крови определяют по калибровочному графику.

Для построения калибровочного графика в пробирки вместо 0,1 мл сыворотки крови вносят по 0,1 мл стандартных растворов глюкозы с концентрациями 5,55 ммоль/л и 16,67 ммоль/л.

Определение глюкозы в крови глюкозооксидазным методом

1. Для определения глюкозы в крови глюкозооксидазным методом готовят опытную и холостую пробы в соответствии с приведенной ниже таблицей:

Отмерить (мл)	Опытная проба (мл)	Холостая проба (мл)
Сыворотка крови	0,05	–
Дистиллированная вода	–	0,05
ТХУ (3% раствор)	0,5	0,5

2. Полученные смеси встряхивают и центрифугируют при 8000g в течение 5 мин.

3. Далее с пробами работают в соответствии со следующей таблицей: из холостой и опытной пробирки отбирают по 0,2 мл надосадочной жидкости и смешивают с 2,0 мл рабочего реагента, который содержит глюкозооксидазу.

Отмерить (мл)	Опытная проба (мл)	Холостая проба (мл)
Надосадочная жидкость	0,2	0,2
Рабочий реагент	2,0	2,0

4. Затем опытную пробу инкубируют в течение 15 мин. при 37С.

5. Оптическую плотность в опытной пробе измеряют при 520 нм против холостой пробы.

6. Концентрацию глюкозы (в ммоль/л) в сыворотке крови определяют с помощью калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика в две пробирки вместо 0,05 мл сыворотки крови вносят по 0,05 мл стандартных растворов глюкозы с концентрациями 5,55 ммоль/л и 16,67 ммоль/л, соответственно.