Определение глюкозы в пробах глюкозооксидазным методом

1. Готовят опытную, стандартную и холостую пробы в соответствии с таблицей:

Отмерить (мл)	Опытная проба	Стандартная проба	Холостая проба
Надосадочная жидкость	0,2	–	–
Стандарт глюкозы	–	0,2	–
Вода	–	–	0,2
Рабочий реагент	2,0	2,0	2,0

2. Пробы тщательно перемешивают.

3. Затем опытную и стандартную пробы инкубируют в течение 15 мин при 37 С

4. Оптическую плотность в опытной и стандартной пробах определяют при 520 нм против холостой пробы (контроля).

5. Концентрацию глюкозы (в ммоль/л) в пробах определяют по формулам:

Для пробы №1

Для проб №2, 3 (4)

где С – концентрация глюкозы в исследуемой пробе, А – оптическая плотность исследуемой пробы, С_ст – концентрация глюкозы в стандартной пробе (5,55 ммоль/л), А_ст – оптическая плотность стандартной пробы, 12 – разведение пробы №1 (при осаждении белков), 6 – разведение проб №2, 3 (4).

Определение молочной кислоты по реакции с п-оксидифенилом

1. Готовят опытную, стандартную и холостую пробы в соответствии с таблицей:

Отмерить (мл)	Опытная проба	Стандартная проба	Холостая проба
Надосадочная жидкость	0,1	–	–
Стандарт молочной кислоты	–	0,2	–
ТХУ	–	–	0,2
Вода	0,1	–	–
Смесь*	0,1	0,1	0,1
Серная кислота, конц.	2,5	2,5	2,5

2. Пробы тщательно перемешивают.

3. Пробирки энергично встряхивают и точно через 3 мин помещают ровно на 3 мин в кипящую водяную баню, затем еще 3 мин охлаждают в ледяной бане.

4. Далее добавляют 0.15 мл (1 каплю) раствора п-оксидифенила в диметилформамиде (наносить нужно точно в центр пробирки), тщательно перемешивают и оставляют стоять 10 мин при комнатной температуре.

5. После этого нагревают на кипящей водяной бане 1.5 мин и охлаждают в воде.

6. Оптическую плотность в опытной пробе определяют спектрофотометрически при длине волны 565 нм против холостой пробы (контроля).

7. Расчет количества молочной кислоты в пробах производят по формуле:

где С – концентрация молочной кислоты в исследуемой пробе, А – оптическая плотность исследуемой пробы, С_ст – концентрация молочной кислоты в стандартной пробе (2,5 ммоль/л), А_ст – оптическая плотность стандартной пробы, 2 – разведение проб при осаждении.

Оформление работы

К занятию:

1. Кратко законспектировать теоретические данные по лабораторной работе.

Во время занятия:

2. Описать этапы работы.

3. Описать результаты.

4. Сделать выводы.

Приложение 1. Структурные формулы основных моносахаридов

(в виде проекционных формул Фишера и перспективных формул Хеуорса)

Триозы	Альдозы (альдотриозы)	Кетозы (кетотриозы)
Тетрозы	Альдозы (альдотетрозы)	Кетозы (кетотетрозы)
Пентозы	Альдозы (альдопентозы)

Пентозы	Кетозы (кетопентозы)
Гексозы	Альдозы (альдопентозы)
	Кетозы (кетопентозы)

Приложение 2. Строение основных олигосахаридов

Сахароза (свекловичный или тростниковый сахар)

Образована молекулами глюкозы и фруктозы, связанными (12) связью:

α-D-Glc-(1→2)-α-D-Fru

Лактоза (молочный сахар)

Образована молекулами галактозы и глюкозы, связанными (14) связью:

β-D-Gal-(1→4)-D-Glc

Мальтоза (солодовый сахар)

Образована двумя молекулами глюкозы, связанными (14) связью:

α-D-Glc-(1→4)-D-Glc

Целлобиоза

Образована двумя молекулами глюкозы, связанными (14) связью:

β-D-Glc-(1→4)-D-Glc

Трегалоза

Образована двумя молекулами глюкозы, связанными (11) связью:

α-D-Glc-(1→1)-α-D-Glc

Раффиноза

Образована путем присоединения дополнительной галактозы α(1→6) связью к глюкозе сахарозы:

α-D-Gal-(1→6)-α-D-Glc-(1→2)-α-D-Fru

Стахиоза

Образована путем присоединения дополнительной галактозы α(1→6) связью к галактозе раффинозы:

α-D-Gal-(1→6)-α-D-Gal-(1→6)-α-D-Glc-(1→2)-α-D-Fru

Лакто-N-фукопентаоза

В основе данного соединения лежит лактоза. К галактозе лактозы присоединена следующая цепочка из моносахаридов: β(1→3) связью D-N-ацетилглюкозамин, β(1→3) связью D-галактоза и α(1→2) связью L-фукоза.

α-L-Fuc-(1→2)-β-D-Gal-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→3)-β-D-Gal-(1→4)-D-Glc

Учебное издание

Авторы:

Бокуть Сергей Борисович,

Сяхович Виталий Эдуардович.

Практикум по общей и экологической биохимии