Изучение влияния уровня амр на скорость гликолиза

1. В соответствии с приведенной ниже таблицей готовят три пробирки: пробирку №1 – контрольная проба; пробирку №2 – инкубируемая проба и пробирку №3 – инкубируемая проба, содержащую высокую концентрацию АМР.

Отмерить (мл)	№1	№2	№3
0,02 М раствор глюкозы	0,5	0,5	0,5
0,06 М раствор АТР	0,5	0,5	–
0,6 М раствор АТР	–	–	0,5
ФСБС	0,5	0,5	0,5

2. Все пробирки помещают на 5 мин в лед.

3. Во все пробирки (не вынимая их изо льда) добавляют по 1,5 мл мышечного экстракта и тщательно перемешивают.

4. Пробу №1 оставляют на льду, а пробы №2 и 3 инкубируют в течение 30 мин при 26° С в водяной бане.

5. После инкубации пробы №2 и 3 помешают на лед.

6. Далее во всех пробах определяют содержание глюкозы и молочной кислоты, для этого с пробами поступают следующим образом:

• из пробы №1 сразу же после добавления экстракта отбирают 0,5 мл инкубационной смеси и переносят в пробирку, содержащую 2,5 мл H₂O, 2 мл 5% раствора ZnSO₄7H₂O и 1 мл 0.3М NaOH, и перемешивают;

• к оставшейся в пробе №1 инкубационной смеси приливают равный объем 5% раствора ТХУ;

• из проб №2 и 3 отбирают 1 мл инкубационной смеси и переносят в пробирку, содержащую 2 мл H₂O, 2 мл 5% раствора ZnSO₄7H₂O и 1 мл 0,3 М NaOH, и перемешивают;

• к оставшимся в пробах №2 и 3 инкубационным смесям приливают равные объемы 5% раствора ТХУ;

• образующиеся осадки белков во всех пробах (и осажденных цинковой смесью, и осажденных ТХУ) удаляют центрифугированием при 3 000 об/мин в течение 10 мин;

• концентрацию глюкозы в супернатантах проб, осажденных цинковой смесью, определяют энзиматическим методом с глюкозооксидазой (методика описана ниже).

• концентрацию молочной кислоты в супернатантах проб, осажденных ТХУ, определяют по реакции с п-оксидифенилом (методика описана ниже).

7. Об интенсивности гликолиза судят по убыли глюкозы и по приросту молочной кислоты.

8. Делают выводы о влиянии АМР на скорость гликолиза.

Изучение влияния цитрата на скорость гликолиза

1. В соответствии с приведенной ниже таблицей готовят четыре пробирки: пробирку №1 – контрольная проба; пробирку №2 – инкубируемая проба; пробирку №3 – инкубируемая проба, содержащая ингибирующую концентрацию цитрата Na и пробирку №4 – инкубируемая проба, содержащую смесь цитрата и АМР.

Отмерить (мл)	№1	№2	№3	№4
0,02 М раствор глюкозы	0,5	0,5	0,5	0,5
0,06 М раствор АТР	0,5	0,5	0,5	0,5
0,3 М раствор цитрата Na	–	–	0,5	–
Смесь цитрат Na / АМР, 0,6 М / 0,3 М	–		–	0,5
ФСБС	0,5	0,5	–	–

2. Пробирки помещают на 5 мин в лед.

3. Во все пробирки (не вынимая их изо льда) добавляют по 1,5 мл мышечного экстракта и тщательно перемешивают.

4. Пробу №1 оставляют во льду, а пробы №2, 3 и 4 инкубируют в течение 30 мин при 26° С в водяной бане.

5. После инкубации пробы №2, 3 и 4 ставят на лед.

6. Далее во всех пробах определяют содержание глюкозы и молочной кислоты, для этого с пробами поступают следующим образом:

• из пробы №1 сразу же после добавления экстракта отбирают 0,5 мл инкубационной смеси и переносят в пробирку, содержащую 2,5 мл H₂O, 2 мл 5% раствора ZnSO₄7H₂O и 1 мл 0.3М NaOH, и перемешивают;

• к оставшейся в пробе №1 инкубационной смеси приливают равный объем 5% раствора ТХУ;

• из проб №2, 3 и 4 отбирают 1 мл инкубационной смеси и переносят в пробирку, содержащую 2 мл H₂O, 2 мл 5% раствора ZnSO₄7H₂O и 1 мл 0,3 М NaOH, и перемешивают;

• к оставшимся в пробах №2, 3 и 4 инкубационным смесям приливают равные объемы 5% раствора ТХУ

• образующиеся осадки белков во всех пробах (и осажденных цинковой смесью, и осажденных ТХУ) удаляют центрифугированием при 3 000 об/мин в течение 10 мин;

• концентрацию глюкозы в супернатантах проб, осажденных цинковой смесью, определяют энзиматическим методом с глюкозооксидазой (методика описана ниже);

• концентрацию молочной кислоты в супернатантах проб, осажденных ТХУ, определяют по реакции с п-оксидифенилом (методика описана ниже).

7. Об интенсивности гликолиза судят по убыли глюкозы и по приросту молочной кислоты.

8. Делают выводы о влиянии цитрата (в присутствии и в отсутствие АМР) на скорость гликолиза.