Тема: обмен углеводов Получение препарата мышечного экстракта для изучения гликолиза Приготовление мышечного гомогената

1. Мышечную ткань крысы по возможности тщательно освобождают от связок, жира и измельчают ножницами.

2. Взвешивают 10 г измельченной ткани и помещают в охлажденный стакан гомогенизатора, содержащий пятикратный объем среды гомогенизации. В качестве среды гомогенизации применяют 0,9%-ый раствор NaCl. В среду гомогенизации рекомендуется добавить никотинамид в конечной концентрации 410^‑2 М для ингибирования нуклеозидазы, расщепляющей NAD⁺.

3. Гомогенизацию проводят в гомогенизаторе со стеклянным или тефлоновым пестиком в течение 10 мин.

4. Гомогенат переливают в мерный цилиндр и средой гомогенизации доводят объем до метки так, чтобы в 1 мл гомогената содержалось 200 мг размельченной мышечной ткани (разведение 1:5).

Получение мышечного экстракта

1. Мышечный гомогенат подвергают центрифугированию при 3 000 об/мин в течение 10 мин для удаления дебриса – остатков разрушенных клеток и ядер. В надосадочной жидкости – экстракте – содержатся цитоплазматические ферменты гликолиза, митохондрии и микросомы.

2. Для удаления митохондрий экстракт дополнительно центрифугируют в течение 10 мин при 11 000 об/мин.

3. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли.

4. Значение рН в полученном экстракте доводят до 7,4.

Гликолиз и его регуляция

Для изучения интенсивности протекания гликолиза в полученном препарате мышечного экстракта, последний инкубируют в среде, содержащей глюкозу, АТР, а также соединения-регуляторы (АТР, ADP или лимонную кислоту) гликолитического пути распада глюкозы. За изменением содержания глюкозы в анализируемых пробах следят с помощью глюкозооксидазного (энзиматического) метода, а накопление молочной кислоты (конечного продукта гликолиза в анаэробных условиях) определяют по реакции с п-оксидифенилом.

Изучение влияния концентрации атр на скорость гликолиза

1. В соответствии с приведенной ниже таблицей готовят три пробирки: пробирку №1 – контрольная проба; пробирку №2 – инкубируемая проба; и пробирку №3 – инкубируемая проба, содержащую АТР в ингибирующей концентрации.

Отмерить (мл)	№1	№2	№3
0,02 М раствор глюкозы	0,5	0,5	0,5
0,06 М раствор АТР	0,5	0,5	–
0,6 М раствор АТР	–	–	0,5
ФСБС	0,5	0,5	0,5

2. Пробирки помещают на 5 мин в лед.

3. Во все три пробирки (не извлекая их изо льда) добавляют по 1.5 мл мышечного экстракта и тщательно перемешивают.

4. Пробу №1 оставляют на льду, а пробы №2 и 3 инкубируют в течение 30 мин при 26° С в водяной бане.

5. После инкубации пробы №2 и 3 переносят в лед.

6. Далее во всех пробах определяют содержание глюкозы и молочной кислоты, для этого с пробами поступают следующим образом:

• из пробы №1 сразу же после добавления экстракта отбирают 0,5 мл инкубационной смеси и переносят в пробирку, содержащую 2,5 мл H₂O, 2 мл 5% раствора ZnSO₄7H₂O и 1 мл 0.3 М NaOH, и перемешивают;

• к оставшейся в пробе №1 инкубационной смеси приливают равный объем 5% раствора ТХУ;

• из проб №2 и 3 отбирают по 1 мл инкубационной смеси и переносят в пробирки, содержащие по 2 мл H₂O, 2 мл 5% раствора ZnSO₄7H₂O и 1 мл 0,3 М NaOH и также перемешивают;

• к оставшимся в пробах №2 и 3 инкубационным смесям приливают равные объемы 5% раствора ТХУ;

• образующиеся осадки белков во всех пробах (и осажденных цинковой смесью, и осажденных ТХУ) удаляют центрифугированием при 3 000 об/мин в течение 10 мин;

• концентрацию глюкозы в супернатантах проб, осажденных цинковой смесью, определяют энзиматическим методом с глюкозооксидазой (методика описана ниже).

• концентрацию молочной кислоты в супернатантах проб, осажденных ТХУ, определяют по реакции с п-оксидифенилом (методика описана ниже).

7. Об интенсивности гликолиза судят по убыли глюкозы и по приросту молочной кислоты.

8. Делают выводы о влиянии АТР на скорость гликолиза.