6.2.Реакцiя аглютинацiї на склi

(див. iнструкцiю по застосуванню сироваток)

Реакцiя аглютинацiї в полiстиролових панелях

При серологiчному групуваннi штамiв менiнгококів, особливо з носоглотки, часто спостерiгається ауто- або полiаглютинацiя. Щоб зняти це явище, необхiдно при постановцi РА використовувати мiкробну суспензiю. Для цього рекомендуються полiстироловi панелі або велике скло, на якому краплi обмежують олiвцем по склу. Для кожної дослiджуваної культури менiнгококiв використовують 1 ряд лунок панелі. Число горизонтальних лунок вiдповiдає числу аглютинуючих групоспецифiчних сироваток. Рiдку сироватку кожної серогрупи у лунці розводять вдвiчi (до 1 краплi сироватки додають 1 краплю суспензiї культури). В окремiй лунцi кожного ряду готують суспензiю дослiджуваної культури. Необхiдна густина суспензiї досягається зливним ростом колонiй на 1/8-1/10 частинi чашки Петрi. Запаяною зiгнутою пастерiвською пiпеткою бактерiальну масу знiмають, ретельно емульгують, спочатку в 2-х краплях фізіологічного розчину, внесеного ранiше в лунку. Потiм для одержання оптимальної робочої густини до суспензiї додають до 1,0 см³ фiзiологiчного розчину. Суспензiю розносять по однiй краплi в горизонтальнi лунки. Панелі струшують протягом 1 хвилини руками або на апаратi для струшування.

Специфiчну реакцiю виявляють та враховують протягом 3 хвилин. Пiзнiший облiк не виключає наявностi реакцiї за рахунок перехресно реагуючих антигенiв. Контролем служить лунка, в якiй готують початкову суспензiю бактерiй у фiзiологiчному розчинi.

Висновок про належнiсть культури до тiєї або iншої серогрупи роблять на основi позитивної реакцiї аглютинацiї з вiдповiдною сироваткою по 4 - хрестовiй шкалi (при вiдсутностi аглютинацiї в фiзiологiчному розчинi).

При наявностi реакцiї аглютинацiї з декiлькома сироватками тест повторюють. Для цього беруть культуру з iншого сектору зливного росту колонiй, ставлять реакцiю з сироватками, що взятi в розведеннi 1 : 2; 1 : 4 i, в разi пiдтвердження попереднiх результатiв, дослiджуваний штам визнають як полiаглютинабельний. У вiдповiдi вказують з якими сироватками спостерігалась позитивна реакцiя i в яких титрах.

Якщо повторення реакцiї аглютинацiї дало iншi результати, тобто культура реагувала тiльки з однiєю сироваткою, роблять висновок про наявнiсть клітин, що чiтко групуються, i полiаглютинабельних клiтин.

Визначення належності пневмококів до того чи іншого серотипу проводять за допомогою РА в пробірках з бульйонною культурою і сироваткою в розведенні 1 : 5 (див. “Інструкцію по використанню сироваток…”)

В цій же реакції або в реакції аглютинації на склі з полі- та монотиповими сироватками визначають належність до певного серотипу H.influenzae.

7. Визначення чутливості до антибіотиків

Для визначення чутливості до антибіотиків використовують стандартний дискодифузійний метод. Можна використовувати для визначення мінімальної подавляючої концентрації метод серійних розведень у середовищі та метод Е-тестів. Крім того, чутливість виділених культур можна вивчати за допомогою автоматичних аналізаторів (наприклад, Vitek) або молекулярно-генетичними методами.

Визначення чутливостi ентеробактерiй та стафiлококiв до антибiотикiв проводять на середовищi АГВ або Мюллер-Хінтона. Ці середовища служать основою для визначення чутливостi до антибiотикiв менiнгококiв при додаванні 20% сироватки або 5% кровi, та пневмококiв - при додаванні 5% кровi, чутливість до антибіотиків гемофілів слід вивчати на НТМ-агарі (Haemophylus Test Medium). Якщо кiлькiсть колонiй, що виросла, мала (1-2), їх вiдсiвають на чашку з відповідним поживним середовищем (кров'яним, сироватковим або “шоколадним” агаром) для накопичення мiкробної маси.

При проведенні досліджень чітко дотримуються вимог стандартної методики внутрішнього контролю постановки тесту (табл.6).

Слід зазначити, що визначення чутливості до S.pneumoniae має деякі особливості:

• Визначати чутливість їх до -лактамних антибіотиків (пеніциліну, амінопеніцилінів, цефалоспоринів, карбапенемів) не можна методом дисків, використовувати слід метод розведення в бульйоні або Е-тестів;

• Неможливо визначити чутливість пневмококів до антибіотиків методом розведення в агарі.

Вивчення чутливості до антибіотиків штамів H.influenzae має свої особливості.

• Для дослідження чутливості до антибіотиків H.influenzae не можна використовувати АГВ, в тому числі і як основу для приготування “шоколадного агару”.

• Посів на чашки необхідно проводити протягом 15 хвилин після приготування інокулюму. Для інокуляції використовують стерильний ватний тампон, який занурюють у суспензію, відтискають надлишок об стінки пробірки і наносять на поверхню агару штрихами у трьох напрямках під кутом 60^о.

• Засіяні чашки термостатують при 371^оС в умовах підвищеної концентрації СО₂ (5-10%).