- •Методичнi вказівки з мiкробiологiчної дiагностики менiнгококової iнфекцiї та гнійних бактерiальних менiнгiтiв вступ
- •1. Показання до лабораторного бактеріологічного обстеження.
- •2.Характеристика основних збудників менінгітів
- •2.1.Мікроорганізми роду Neisseriа
- •2.2.Мікроорганізми роду Haemophilus
- •2.3.Пневмококи
- •3. Взяття і доставка матеріалу для лабораторного дослідження
- •Первинні середовища, необхідні для первинного посіву матеріалу
- •4. Порядок проведення досліджень
- •Властивості основних збудників гбм, якi враховуються через 24 години вiд початку бактерiологiчного дослiдження ліквору або крові
- •Диференцiальні властивостi стрептококiв та ентерококів якi викликають менiнгiт
- •Біотипування h.Influenzae
- •5.Методи бактеріологічного та біохімічного вивчення менінгококів, пневмококів та гемофілів
- •5.1.Створення пiдвищеної концентрацiї вуглекислого газу для культивування посiвiв
- •5.2.Проба на каталазу
- •5.3.Проба на оксидазу
- •5.4.Визначення сахаролітичної активності
- •5.8.Застосування дискiв з жовчу для iдентифiкацiї збудників менінгітів
- •5.9.Оптохіновий тест
- •5.10.Визначення ферменту уреази
- •5.11.Визначення індолоутворення
- •5.12.Визначення наявності орнітиндекарбоксилази
- •5.13.Визначення наявності β-галактозидази у штамів h.Influenzae
- •6.Методи серологiчної дІагностики та типування збудників гнійних бактеріальних менінгітів
- •6.1.Реакція латекс-аглютинації.
- •6.2.Реакцiя аглютинацiї на склi
- •Реакцiя аглютинацiї в полiстиролових панелях
- •7. Визначення чутливості до антибіотиків
- •8. Термiни видачi вiдповiдi та її формулювання
- •10. Зберiгання та транспортування видiлених культур
- •11.Організаційно-методична робота бактеріологічних лабораторій
- •12.Обов’язки спеціалістів лабораторій, що проводять дослідження з метою діагностики гнійних бактеріальних менінгітів.
- •13. Штами для контролю якості поживних середовищ та постановки тестів ідентифікації
- •Зони інгібіції тест-штамів на середовищі Мюллер-Хінтон.
- •14. Вимоги безпеки
- •Культуральнi та бiохiмiчнi властивостi нейсерiй I m.(b.) catarrhalis
- •Приготування поживних середовищ та індикаторів
- •1.Сироватковий агар
- •1.1.Сироватковий агар з ристомiцином
- •1.2.Сироватковий агар з лiнкомiцином
- •2.Кров'яний агар
- •3."Шоколадний" агар (кип’ячений)
- •3.1.Шоколадний бульйон
- •3.2.Середовище Левінталя
- •4.Жовчно - сироватковий агар
- •5. Середовища з вуглеводами для визначення сахаролітичних властивостей нейсерій
- •6.Середовище для визначення продукції полісахаридів на агарі з 5% сахарози
- •7.Середовище для тесту відновлення нітратів в нітрити
- •8.Нтм агар (Середовище для тестування гемофілів)
- •9.Реактиви для визначення ферменту уреази за методом Заксе Готується 2 реактиви: а і в.
- •10.Реактив Грісса
- •11.Реактив Касаткіна
- •12.Індикатор феноловий червоний (фенолрот)
- •13.Водний розчин Люголя
- •Застосування реакцiї непрямої гемаглютинацiї для виявлення протименiнгококових антитiл
- •Показання до проведення серологiчних дослiджень
- •2. Реакцiя непрямої гемаглютинацiї (рнга) з еритроцитарними менiнгококовими дiагностикумами
- •Забiр кровi
- •Рекомендованi терміни, кратнiсть обстеження та трактування результатiв серологiчних досліджень
- •4.1. Рнга при генералiзованих формах менiнгококової iнфекцiї
- •4.1.1. Рнга з дiагностикумами а I с
- •4.1.2. Рнга з дiагностикумом серогрупи в
- •4.1.3.Групова специфiчнiсть рнга
- •4.2. Рнга при локалiзованих формах менiнгококової
- •Iнфекцiї (назофарингiт I бактерiоносiйство)
- •4.3.Рнга при iмуно-епiдемiологiчних дослiдженнях
- •4.4. Застосування рнга для оцiнки ефективностi вакцинопрофiлактики менiнгококової iнфекцiї
Первинні середовища, необхідні для первинного посіву матеріалу
від хворих на менінгіти.
Матеріал |
Поживні середовища |
|||||||||||
КА |
ША |
ЖСА + |
Менінгоагар |
МПА
|
Ендо |
Сабуро |
Тіогліколеве |
Сироватковий агар |
||||
Тверд. |
Напіврідк |
з антибі-отиками |
||||||||||
Слиз носоглотковий |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
+ |
+ |
|
Ліквор |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
+ |
+ |
+ |
|
|
Кров |
+ |
+ |
|
+ |
|
|
|
+ |
+ |
+ |
|
|
Секційний матеріал |
+ |
+ |
|
|
|
|
|
+ |
+ |
+ |
+ |
|
Ексудат із петехій |
+ |
+ |
|
+ |
|
|
|
|
|
|
+ |
|
4. Порядок проведення досліджень
Спинномозкова рідина (СМР).Мікробіологічне дослідження ліквору складається з бактеріоскопії мазка, виділення збудника та його ідентифікації, серологічної детекції антигенів у СМР. Ліквор досліджують негайно після доставки в лабораторію. Якщо рідина мутна, посів здійснюють без попередньої підготовки. Прозору рідину центрифугують 5 хвилин при 3000 об/хв, осад висівають та мікроскопують. З матеріалу готують мазок, висушують на повітрі, фіксують сумішшю Нікіфорова протягом 5 хвилин і фарбують метиленовим синім або за Грамом в модифікації Калини. Не можна фіксувати мазки в полум’ї пальника або спиртівки!
Бактеріоскопічне дослідження проводять уважно, ретельно переглядаючи як мінімум 20 полів зору, або до того часу, поки бактерії не будуть виявлені. Пряма мікроскопія дозволяє встановити наявність бактерій, що викликали захворювання.
N.meningitidis можуть розташовуватись поза клітиною або всередині лейкоцитів, за Грамом забарвлюються негативно, виглядають як диплококи схожі на зернини кави.
H.influenzae в мазках - дрiбні грамнегативні кокобактерії або палички, схильні до поліморфізму, оточені ледь помітною ніжною капсулою, розташовані у вигляді коротких ланцюжків або ниток.
Пневмококи мають вигляд ланцетовидних диплококiв та коротких ланцюжкiв, утворюють капсулу; вони грампозитивнi, добре фарбуються усіма аніліновими барвниками, при цьому капсула залишається безбарвною i помітна тільки на забарвленому фоні.
Опис морфології інших бактерій викладений у відповідних нормативних документах та довідниках.
Виявлення в мазках типових менінгококів або інших мікроорганізмів є підставою для видачі попередньої відповіді, про що негайно інформують лікаря лікувально-профілактичної установи.
Виділення збудника. Стерильною пастерівською піпеткою з дна пробірки беруть 0,3-0,5 см3 матеріалу і по 2-3 краплі засівають: на сироватковий, 5% кров’яний, “шоколадний” (або середовище Левінталя) агари і на середовище для контролю стерильності. При необхідності, в залежності від результатів мікроскопії осаду, можна додатково зробити посів на середовища ЖСА і Ендо. Така різноманітність середовищ, що використовується для первинного посіву СМР дозволяє прискорити виділення мікроорганізмів, які можуть бути чинниками бактеріальних менінгітів. Посіви поміщають в термостат при температурі (37±1)оС і створюють умови з підвищеною концентрацією СО2 (5-10%).
При наявності достатньої кількості СМР рекомендується 2-3 краплі засіяти на чашку з АГВ або середовищем Мюллер-Хінтона і визначити чутливість мікроорганізма до антибіотиків.
Решту СМР використовують для проведення серологічних досліджень (коаглютинація, латекс-аглютинація, імуноферментний аналіз, ЗІЕФ), полімеразної ланцюгової реакції, тощо та для посіву у середовище збагачення (4 смз 0,1 % напіврідкого агару з 1 смз сироватки). Посіви СМР витримують у термостаті до 7 діб при температурі (371)оС з періодичними висівами на тверді поживні середовища.
Через 24 години візуально та за допомогою стереоскопічного мікроскопа переглядають усі чашки з посівами незалежно від результатів попередньої бактеріоскопії ліквору. Чашки без росту інкубують ще добу. До уваги беруть усі різновиди колоній.
Менінгокок на сироватковому агарi утворює плоскі, круглі з рівним краєм, нiжнi колонiї з опалесценцією розмiром 2-3 мм. На "шоколадному" та кров’яному агарах його колонiї нiжнi, сiруватого кольору, з блискучою поверхнею та рiвними краями, мають маслянисту консистенцiю, розмiрами до 3,0 мм. Менiнгококи не змiнюють кольору середовища.
Гемофiли на «шоколадному» агарi дають досить пишне розростання, їм притаманний різкий специфічний запах індолу. Колонiї сiрого кольору, плоскi, дiаметром 0,2-2,0 мм, легко знiмаються з середовища. На кров’яному агарі через добу з’являються дрібні прозорі колонії, схожі на краплинки роси або взагалі ріст може бути відсутнім. На МПА та сироватковому агарі H.influenzae не росте.
Колонiї пневмококiв на кров’яному, як і на «шоколадному» агарі, дрiбнi (дiаметром 0,1-1,0 мм), сіруваті, плоскi, iнодi з вдавленим центром, оточенi зоною -гемолiзу. За зовнiшнім виглядом колонiї пневмококiв важко вiдрiзнити вiд колонiй стрептококiв групи В, інших «зеленячих» стрептококiв – SS.mitis, oralis, sanguis, parasanguis, gordonii та ентерококiв (Е.faecalis), якi в деяких випадках можуть викликати менiнгiт, особливо у дiтей до 1 року. На сироватковому агарі пневмококи утворюють дрібні, ніжні ледь жовтуваті колонії. Пневмококи при рості на кров’яному агарі можуть давати декілька типів колоній, що залежить від того, на скільки виражена капсула. Колонії пневмокока з розвинутою капсулою можуть мати декілька міліметрів в діаметрі і бути настільки слизистими, що нагадують краплину олії на поверхні агару. Їх розпізнавання не викликає труднощів. Штами, у яких не виражена капсула, дають колонії невеликих розмірів і їх виділення пов’язане з певними труднощами. При перегляді цих колоній у стереоскопічний мікроскоп можна розгледіти характерні морфологічні особливості росту цього мікроорганізма: сіруватий відтінок колоній, випукла поверхня і волога “сметаноподібна” консистенція. При тривалому інкубуванні (48 годин і більше) центральна частина колонії може опуститись, надаючи їй характерну блюдцеподібну форму (це, певною мірою, пояснюється дією аутолізинів пневмокока). Деякі штами можуть давати абсолютно сплющені колонії.
Останнім часом спостерігаються поодинокі випадки та спалахи гнійних менінгітів, які викликані піогенним стрептококом (S.pyogenes). Колонії цього збудника легко відрізнити від інших стрептококів по зоні β-гемолізу на кров'яному агарі.
Великi (3-5мм) колонiї, які мiстять в собi грамнегативнi палички, слід запiдозрити у належності до ентеробактерiй та псевдомонад.
Гриби роду Candida ростуть на всiх середовищах, не змiнюючи кольору агару з кров’ю.
Мікроорганізми роду Acinetobacter добре ростуть на кров’яному і сироватковому агарах, а також на поживних середовищах без додавання нативного білка. Утворюють великі, білі, круглі й блискучі, часто слизисті колонії, на середовищах з кров’ю можуть давати зону гемолізу.
Для визначення чистоти культури та подальшого шляху ідентифікації готують мазки, фарбують за Грамом, ставлять реакцію з 3% розчином КОН та перші найпростіші біохімічні тести на оксидазу, каталазу (при підтвердженні чистоти культури), а також відсівають колонії на елективні середовища для накопичення чистої культури для подальшої ідентифікації.
Ідентифікація збудника менінгіту. Враховуючи характер росту, морфологію клітин і результати вказаних біохімічних тестів, вирішують ймовірну належність вирощеного мікроорганізму до того чи іншого роду й обирають шлях подальшого його вивчення й ідентифікації.
В таблицi 2 пiдсумовано мiнiмальну кiлькiсть ознак, достатнiх для того, щоб видiленi бактерiї попередньо зарахувати до того або iншого таксону й обрати подальший шлях iдентифiкацiї. На цьому етапi можлива видача попередньої вiдповiдi.
Колонiї, пiдозрiлi на менiнгокок, вiдсiвають на СА для отримання та накопичення чистої культури, яку в подальшому ідентифікують за характерними властивостями та вивчають її чутливість до антибіотиків. Для диференціації N.meningitidis і B.(M)catarrhalis культуру відсівають у дві пробірки з СА та одну – з поживним агаром (МПА). Посіви на СА вирощують паралельно при температурі (37±1)оС та (22±1)оС, на МПА – при (37±1)оС. Одночасне культивування виділеного збудника на МПА і СА є простим і надійним тестом, що дозволяє диференціювати Neisseria meningitidis, не здатну рости на СА при (22±1)оС та на МПА при (37±1)оС, від схожої на неї B.(M)catarrhalis. Вивчають біохімічні властивості нейсерій: відсутність росту на агарі з 0,2% вмістом жовчі або затримка росту навколо дисків з жовчу; активність у відношенні до вуглеводів (глюкози, мальтози, сахарози, фруктози, лактози); редукція нітратів; здатність утворювати полісахарид на середовищі з 5% вмістом сахарози (додаток1).
Таблиця 2