19. Хлорофиллы, химическая структура, химические и физические (спектральные) свойства, биосинтез хлорофилла, функциональное и экологическое значение спектрально-различных форм.
Пигменты – это вещества, избирательно поглощающие свет в видимой части спектра. При освещении белым светом их цвет определяется только лучами, которые они отражают или пропускают. Способность пигментов поглощать свет, связано с наличием в их молекулах правильно чередующихся двойных и одинарных связей. Это так называемые сопряженные или коньюгированные связи. Между двумя атомами, связанными двойными связями, находится 4 электрона. Когда система состоит из сопряженных связей, то половина этих электронов может свободно перемещаться вдоль этой системы. Поглотив квант света, такой электрон может оторваться от молекулы пигмента, т. е. становится донором электронов для восстановления веществ.
В 1818 году французы Ж. Пелтье и Ж. Ковенту выделяли из листа зеленое вещество и назвали его хлорофиллом (от греч. хлорос – зеленый, филон –лист). В другой половине ХIХ в ученые уже знали о тесной связи фотосинтеза с этим зеленым веществом. Начались его исследования.
Ч. Дарвин назвал хлорофилл самым интересным веществом на Земле, а сейчас это вещество занимает первое место в мире среди органических соединений по количеству напечатанных статей.
В 1860 г. француз Э. Фреми разделил зеленый экстракт, полученный из листа, на две части: голубовато-зеленую и желтую. Первую он считал хлорофиллом, вторую ксантофиллом. В 1864 г. англичанин Д. Стокс сделал вывод, что экстракт состоит из четырех пигментов: двух зеленых и двух желтых. Такие же результаты получил Г. Сорби в 1878 г. Но на их исследования никто не обратил внимания.
И только после того, как в 1882 г. И. П. Бородин (Россия) получил хлорофилл в чистом кристаллическом виде, а М. С. Цвет (Россия) в 1901 г. предложил хромотографический метод, исследования пигментов пошли очень быстро.
Изучением желтых пигментов занимались А. Арно (1885–1887 гг., Франция), Г. Молиш (1894–1896 гг., Австрия). Большой вклад в изучении биосинтеза и функций хлорофилла сделан советской школой фотосинтетиков академиками А. А. Красновским, Т. Н. Годневым, А. А. Шлыком.
Сейчас известно, что высшие растения содержат две формы зеленых пигментов: хлорофиллы а и b и две формы желтых пигментов (каротиноиды): каротины и ксантофиллы.
Главную роль в фотосинтезе играет хлорофилл а. Строение молекулы его было установлено во втором десятилетии прошлого века, а четверть века спустя синтезирована молекула хлорофилла, которая ничем не отличалась от природной.
Однако, хлорофилл – это только один из компонентов фотосинтезирующей системы. Поэтому пока все еще не удается осуществить процесс фотосинтеза в пробирке.
Хлорофилл является сложным органическим веществом. Одной из главных трудностей для выявления точного химического состава хлорофилла является его полная нерастворимость в воде и легкая изменчивость под воздействием солей, кислот и щелочей. Суммарный химический состав молекулы хлорофилла можно выразить следующей формулой:
хлорофилл а С55Н72О5N4Mg
хлорофилл b С55Н70О6 N4Mg
Указанные хлорофиллы отличаются одним атомом кислорода и двумя водорода, а по цвету хлорофилл а – сине-зеленый; b – желто-зеленый.
По химической природе хлорофилл представляет собой сложный эфир дикарбонатовой кислоты хлорофиллина, в одном карбоксиле которой водород замещен остатком метанола, а в другом – фитола:
В основе молекулы лежит порфирин, который состоит из четырех пирольных колец (пронумерованы римскими цифрами), соединенных метиновыми мостиками (–СН=). В центре порфиринового ядра находится атом Mg, связанный с N. Таким образом, хлорофилл относится к Mg-порфиринам. Порфирины входят также в состав гема крови и являются важным компонентом систем, принимающих участие в дыхании; в этом случае вместо магния они содержат железо.
Кроме пирольных в состав молекулы хлорофилла входит циклопентановое кольцо (V), которое содержит высокоактивную кетогруппу и участвует в окислении воды. Хлорофилл b отличается от хлорофилла а тем, что по второму пирольному кольцу присоединена не метильная, а альдегидная группа. Четыре пирольных кольца и метиновые мостики образуют двойные связи. Между двумя атомами, связанными двойными атомами, находится 4 электрона. Когда система состоит из двойных связей, то половина этих π-электронов, как отмечалось, может свободно перемещаться вдоль системы.
Молекулу хлорофилла делят на две части: порфириновое ядро и фитольный хвост. Фитольный хвост в два раза длиннее ядра. Порфириновое ядро благодаря наличию атомов кислорода и азота гидрофильно. Фитольный хвост – это углеводородная, а это значит гидрофобная часть молекулы хлорофилла. Поэтому порфириновое ядро размещается в гидрофильной части мембраны тилакоида, а фитольный хвост в гидрофобной. Имея разные свойства, две части молекулы хлорофилла выполняют разную функцию: порфириновое ядро содержащее коньюгированные связи, поглощает свет, а фитольный хвост играет роль якоря, который удерживает молекулу хлорофилла в определенной части мембраны тилакоида.
Таким образом, мы видим, что подобно тому, как отдельные органы многоклеточного организма или органеллы в клетке имеют определенное строение и выполняют в связи с этим особую функцию, так и особые части молекулы хлорофилла владеют специальными свойствами, а соответственно и функциями.
Щелочь отсекает от молекулы хлорофилла фитольный хвост, в результате образованная соль теряет способность растворяться в бензине, но сохраняет зеленый цвет хлорофилла. Следовательно, растворимость пигмента в бензине, его гидрофобность обусловлена остатком фитола, а поглощение света связано с порфириновым ядром. Атом магния также влияет на поглощение света молекулой хлорофилла. Если с помощью кислоты заместить магний на водород, то образовавшееся вещество – феофитин принимает красно-бурый цвет вместо зеленого.
В природных условиях образование феофитина происходит осенью, при старении листьев, под воздействием неблагоприятных факторов. В результате листья желтеют. При влиянии различных факторов происходит увеличение проницаемости мембран, и кислый вакуолярный сок, проникая в хлоропласты, преобразует хлорофилл в феофитин. Поскольку избирательная проницаемость мембран нарушается под воздействием разных факторов, то листья желтеют под воздействием низких и высоких температур, дефиците воды и ее избытке и т. д.
В настоящее время считают, что роль Mg в поглощении света связана с тем, что он, во-первых, изменяет симметрию молекулы хлорофилла таким образом, что все сопряженные связи и сама молекула находятся в одной плоскости. Когда молекула по каким-либо причинам принимает другую форму, то взаимодействие π-электроновых облаков нарушается, цепь сопряжения разъединяется, цвет пигментов изменяется или пропадает. Во-вторых, магний придает молекуле хлорофилла способность соединяться с другими молекулами этого пигмента. И, в-третьих, магний необходим для сохранения возбужденного состояния молекулой хлорофилла. Так, тетрапиролы, содержащие вместо магния железо, быстро рассеивают свет.
Хлорофилл а – самый важный из фотосинтетических пигментов, он присутствует во всех фотосинтезирующих растениях. Существуют и другие формы хлорофиллов (b, с1, с2 и d), которые называются вспомогательными
Распространение основных фотосинтетических пигментов в природе приведено в табл. 2.2.
Если хлорофилл а in vivo встречается во всех видах растений, то b – у высших растений и двух семейств водорослей (зеленые и эвгленовые), а фикобилины только в водорослях трех семейств: красные, сине-зеленые и криптофитовые.
Предшественником всех хлорофиллов является δ-аминолевулиновая кислота (δАЛК). Известны два метаболических пути образования δАЛК: путь Шемина и путь Биле. Оба пути функционируют в растениях. В основе пути Шемина у животных, бактерий, эвглен и грибов – конденсация сукцинил-СоА и глицина с образованием α-амино-β-кетоадипиновой кислоты. Глицил – радикал немедленно декарбоксилируется в δАЛК. Реакцию катализирует АЛК-синтетаза. Активность АЛК-синтетазы обнаружена в хлоропластах. Однако доля δАЛК, синтезированной из глицина, крайне мала по сравнению со всей δАЛК, участвующей в синтезе тетрапиррола. Путь Биле катализируют ферменты, часть которых растворены в строме хлоропластов, а другие тесно связаны с мембранами. В 1974 г. Биле и Кастелфранко показали, что глутамат и α-кетоглутарат являются субстратами для синтеза δАЛК. Путь Биле обнаружен в хлоропластах высших растений, водорослях, включая эвглену, фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих бактериях.
Активация глутамата. Было доказано, что биосинтез δАЛК зависит от t -РНК. Это подтвердило гипотезу Гассмана и Богорада (1967) об участии нуклеиновых кислот в биосинтезе хлорофилла. Путем секвенирования было показано, что t-РНК имеет антикодон УУЦ, специфичный к глутамину. Глутамат t-РНК-лигаза, кодируемая ядерным геном, катализирует присоединение t-РНК к первому углероду глутамата. В качестве кофакторов используется ион магния и АТФ. Глутамил-t-РНК комплекс превращается в глутамат 1-семиальдегид (Г1СА) с участием оксидоредуктазы с кофактором НАДФН. Превращение Г1СА в δАЛК катализируется витамином В6 и пиридоксальфосфатзависимым ферментом – ГСА-аминотрансферазой. Некоторые авторы допускают наличие промежуточных соединений. Также предполагают, что δАЛК возникает в результате неферментативной конденсации двух молекул ГСА. Реакции от δАЛК до протопорфирина IX являются общими при биосинтезе хлорофилла и гема.
Порфобилиноген (ПБГ) образуется в реакции асимметричной конденсации двух молекул δАЛК с освобождением двух молекул воды. Фермент АЛК-дегидратаза связан с металлом: с цинком у бактерий и с магнием у растений. Ингибируется кадмием и свинцом. В образовании уропорфириногена III участвуют два фермента: ПБГ-деаминаза и УроIII-синтетаза. Полимеризуются четыре молекулы ПБГ с образованием линейного и очень лабильного тетрапиррола (первый фермент); замыкается в кольцо вторым ферментом. УроIII-синтетаза очень нестабильна даже при комнатной температуре.
Образование копропорфириногена III катализируется ферментом уродекарбоксилазой, который кодируется геном hem12. Образование протопорфириногена IX происходит при окислительном декарбоксилировании двух пропионовых остатков в А и В кольцах копрогена-III с участием копрогеноксидазы, и образуется дивинилпротопорфириноген 9 (DV-протоген 9). Возможен также выход моновинилпротопорфирина 9 (MV-протоген 9). Образование протопорфирина IX происходит в результате удаления шести электронов из ППГ-IX. На этапе от протопорфирина к протохлорофиллиду происходит захват иона магния (фермент магний-хелатаза связан с мембраной и требует АТФ). Этерификация магний-протопорфирина-9 в магний – протопорфирин-9 монометиловый эфир, образование изоциклического кольца приводят к образованию протохлорофилла. Свойственно хлорофиллам.
Протохлорофилл описывают в двух формах: моновинильной и дивинильной. Выделяют следующую группу растений: накапливающие дивинил в темноте и на свету (огурцы, хвойные); содержащие моновинильную форму в темноте и дивинильную на свету (однодольные, бобы); синтезирующие дивинильную форму в темноте и моновинильную на свету (виола, гинкго); имеющие только моновинильную форму (яблоня). По-видимому, на самом деле в каждом растении присутствуют обе формы, но в разной пропорции и в зависимости от стадий развития растений. Хорошо известно, что покрытосеменным растениям необходим свет для синтеза хлорофилла, тогда как остальные способны к его синтезу и в темноте.
На последнем этапе биосинтеза протохлорофиллид превращается в хлорофилл а. Для световой трансформации протохлорофиллида в хлорофиллид с участием НАДФН-зависимой фотооксидоредуктазы достаточно 10-микросекундной вспышки. Кодируется ядерной ДНК. Действительным субстратом является возбужденный протохлорофиллид. Фотоактивный протохлорофиллид существует в двух промежуточных комплексах (Р638-642 и Р650-657), причем второй преобладает. Фотоактивный протохлорофиллид имеет одну полосу флюоресценции при 657 нм. Фотонеактивный протохлорофиллид назван так, поскольку превращается в хлорофиллид не очень быстро.
Первым продуктом фоторедукции является хлорофиллид (С676-688) после присоединения двух остатков водорода в 17 и 18 позициях. После его образования развиваются два различных спектральных сдвига (шифта). Первый из них (коротковолновый) происходит через несколько секунд с образованием С670-675, что объясняют отделением хлорофиллида от фермента. Это главный сдвиг в пропластидах. Второй сдвиг в длинноволновую область происходит обычно за 30 секунд. Конечный продукт –хлорофиллид в комплексе с НАДФ и ферментом. Этот сдвиг обычно бывает у этиопластов. После длинноволнового сдвига в поглощении и флюоресценции максимум хлорофиллида претерпевает другой сдвиг в коротковолновую сторону (С672-682) в течение 30 минут. Это хорошо известный сдвиг Шибата (1957) за счет разделения хлорофиллида и фермента. Во время сдвига хлорофиллид интенсивно этерифицируется геранил-гераноил – пирофосфатом, который через дигидрогеранилгераноил и тетрадигидрогеранилгераноил превращается в фитол (хлорофилл-синтетаза). Превращением форм хлорофилла занимались Красновский, Литвин, Богорад, Шлык.
Независящая от света реакция восстановления протохлорофиллида с участием НАДФ существует у хламидомонады, родобактера, цианобактерии. Хорошо известно, что хлорофилл на свету деградирует и должен постоянно синтезироваться de novo. Удивительно, что образование хлорофиллида из протохлорофиллида происходит одинаково в зеленеющих и зеленых листьях. Спектр живого листа зависит от присутствия различных форм хлорофилла и каротиноидов. В полной темноте листья или проростки накапливают небольшие количества протохлорофиллида. Это показывает, что все ферменты активны. Длительное пребывание в темноте (более шести дней у однодольных и десяти дней у двудольных растений) приводит к постепенному уменьшению содержания протохлорофиллида (вероятно, в результате ингибирования реакции синтеза гема АЛК протохлорофиллидом). Во время зеленения, когда этиолированные листья попадали на свет, фотоактивный пул прохлофиллида восстанавливался до хлорофиллида. Об-разование хлорофилла на свету имеет лаг – фазу, за время которой активируется АЛА-синтетаза. В зеленеющих листьях и проростках диурон ингибирует синтез хлорофилла (вероятно, опосредованно, через ТФ и окислительно-восстановительное состояние переносчиков). Абсцизовая кислота подавляет синтез хлорофилла и действует как антагонист цитокинина. Бензиладенин устраняет лаг-фазу образования хлорофилла, вероятно стимулируя синтез АЛК. В регуляции синтеза хлорофилла принимает участие фитохромная система
20. Билихромопротеины (фикобиллины), распространение, химическое строение, спектральные свойства, функциональное и экологическое значение спектрально-различных форм пигментов у фотосинтезирующих организмов.
К пигментам, которые участвуют в световой стадии фотосинтеза, относятся и фикобилины. Все фотосинтетические пигменты (хлорофиллы, каротиноиды и фикобилины) входят в состав пигментных систем в виде хромпротеинов, т. е. пигмент – белковых комплексов. Хлорофиллы и каротиноиды связаны с белками относительно слабо, связь между пигментом и белком нековалентная. Поскольку такие связи легко нарушаются хлорофиллы и каротиноиды можно экстрагировать с помощью органических растворителей таких как ацетон, спирт.
Фикобилины связаны с белком ковалентно, поэтому они находятся в виде молекул – фикобелипротеинов. Фикобилипротеины растворимы в воде и легко вымываются из мацерированных тканей водой или разбавленными растворами солей. Однако, для разрушения молекулы фикобелипротеинов путем расщепления связи между пигментом и белком необходим гидролиз в жестких условиях.
По структуре фикобелины – тоже тетрапироллы, но с открытой цепью, которые имеют систему коньюгированных двойных и одинарных связей. У фикобилинов четыре остатка пиррола вытянуты в открытую цепь таким образом, что замкнутого порфиринового кольца в них не образуется. В своем составе они не содержат атомов Mg, или других металлов, а также фитола. Эти пигменты делят на две основные группы в соответствии с их цветом – красные (фикоэритрины) и синие (фикоцианины).
Название «фикобилины» предложил Лемберг (20-е гг. ХХ века) из-за их подобия с желтыми пигментами.
Фикоэритрин и фикоцианин состоят из двух разных белковых субъединиц: α (молекулярная масса ~ 19 000) и β (~ 21 000). Стехиометричные отношения α- и β-субъединиц составляют 1:1. Каждая из белковых субъединиц несет ковалентно связанный с ней фикобилин, при этом субъединицы, выделенные из разных организмов, могут нести разное количество молекул фикобилина – от одной до четырех. Как правило, фикобилины, связанные с одной субъединицей, относятся к одному типу (т. е. к фикоэритробилинам или фикоцианобилинам); в результате получаются красные или синие субъединицы. В некоторых случаях субъединица несет на себе два типа фикобилинов, но тогда один из типов является преобладающим. In vivo белковая субъединица встречается в виде агрегатов (α, β)n, где n равно 3 или 6, что соответствует молекулярным массам около 134 или 268 кД.
К фикобилинам относятся также аллофикацианин. Он назван так потому, что его сначала принимали за одну из форм фикоцианина. Аллофикацианин присутствует в небольших количествах в водорослях семейств красных и сине-зеленых. В отличие от других фикобилипротеинов его молекула состоит только из одного типа белковых субъединиц (молекулярная масса ~ 15 кД), при этом каждая субъединица несет одну молекулу аллофикацианина. In vivo она объединяется в агрегаты с молекулярной массой ~ 10 кД, состоящих из шести субъединиц.
В клетках водорослей фикобилипротеины агрегируются один с другим, образуя гранулы, которые называются фикобилисомами. Фикобилисомы образуют упорядоченные ансамбли на поверхности тилакоидных мембран.
Каротиноиды и фикобилины, как и хлорофиллы b, с1, с2 и d, называют вспомогательными или сопутствующими пигментами. Это определяется их функциями, о которых мы будем говорить дальше.