Нитрат нитрит нитроксил гидроксиламин аммоний

Показано, что нитратредуктаза относится к индуцибельным ферментам. Ее новообразование вызывается присутствием в среде нитратов. Вместе с тем накопление продукта реакции — нитритов репрессирует образование нитратредуктазы. Интересно, что фитогормоны цитокинины также индицируют синтез нитратредуктазы.

Восстановление нитратов до аммиака катализируется ферментом нитритредуктазой и идет через образование нитроксилa (NOH) и гидроксиламина (NH₂OH) в качестве вероятных промежуточных соединений. Однако надо сказать, что этот процесс изучен недостаточно. Промежуточные соединения не выделены, не исключено, что они являются иными.

Для восстановления нитратов необходимо присутствие донора водорода и электронов, которыми являются восстановленные никотинамиды (НАДФ-Н₂ или НАД-Н₂). В свою очередь поставщиком этих соединений являются процесс дыхания и отчасти световые реакции фотосинтеза. Именно поэтому восстановление нитратов тесно связано с дыхательным газообменом. Вместе с тем для нормального протекания процесса дыхания растение должно быть достаточно обеспечено углеводами. При искусственном снижении содержания углеводов (выдерживание растений в темноте) нитраты не восстанавливаются, а накапливаются во всех органах растения. При усиленном поступлении нитратов содержание углеводов падает.

Интересно, что растения-нитратонакопители, к которым относятся некоторые среднеазиатские солянки, содержат мало углеводов и большое количество органических кислот. Большое влияние на восстановление нитратов оказывает свет. Прежде всего, на свету в процессе фотосинтеза образуются углеводы, необходимые для восстановления, а также для дальнейшего превращения нитратов. Вместе с тем для восстановления нитратов могут быть непосредственно использованы продукты, образующиеся в процессе нециклического фотофосфорилирования (НАДФ-Н₂, АТФ). Восстановление нитратов стимулируется при освещении синим светом. Возможно, это связано с тем, что флавин, который входит в состав нитратредуктазы, поглощает синий свет и активируется им.

Наряду с нитратами в растение могут поступать и нитриты, которые также подвергаются восстановлению до аммиака. Однако нитриты при накоплении могут оказаться ядовитыми. Нитриты образуются в цитоплазме, фермент нитритредуктаза локализован в хлоропластах. Передвижение нитритов в хлоропласты стимулируется Са. При недостатке Са нитриты не восстанавливаются до аммиака и накапливаются в клетках. Установлено, что в высших растениях, так же как у прокариот и грибов, наряду с восстановлением нитратов до аммиака осуществляется и обратный процесс — окисление аммонийной формы азота в нитратную, что опровергает широко распространенное мнение об исключительно экзогенном происхождении нитратов в растениях (Б. А. Ягодин).

Важнейшим источником азотного питания является аммонийный азот. При этом он поступает в растения даже быстрее, чем нитраты. Более быстрое поглощение аммиака объясняется тем, что для его использования на построение органических веществ не требуется предварительного восстановления, которое необходимо при питании растений нитратами. Аммиак представляет собой основное и, по-видимому, единственное соединение, вовлекаемое в процессы азотистого обмена. При этом аммиак может быть разного происхождения: непосредственно поступивший из почвы, образовавшийся в результате восстановления нитратов или в результате вторичного распада белка в стареющих органах и клетках. Важно отметить, что накопление аммиака в клетках, как растений, так и животных приводит к нежелательным последствиям и даже отравлению организма. Однако растения обладают способностью обезвреживать аммиак путем присоединения его к органическим кислотам с образованием амидов (глутамина, аспарагина). Этот процесс аналогичен обезвреживанию аммиака животными организмами в виде мочевины.

Существует целая группа растений, накапливающая большое количество органических кислот и с их помощью обезвреживающая аммиак, образуя соли. Это позволило разделить растения на амидные, образующие амиды — аспарагин и глутамин, и аммиачные, образующие соли аммония. Изменяя рН клеточного сока, можно менять направление азотистого обмена, превращать растения с амидным типом обмена в аммиачные и наоборот.

Каковы же пути образования амидов в растениях? В процессе дыхания в качестве промежуточных продуктов образуются органические кислоты, в том числе α-кетоглутаровая и щавелевоуксусная. Эти кислоты в результате реакции прямого восстановительного аминирования присоединяют аммиак.

Катализируется реакция ферментов глутаминдегидрогеназой с активной группой НАД. Этот фермент локализован главным образом в митохондриях, так как именно в этих органеллах образуются органические кислоты и восстановленные никотинамидные коферменты. Аспарагиновая кислота образуется по аналогии с глутаминовой кислотой путем восстановительного аминирования щавелевоуксусной кислоты. Наконец, путем аминирования пировиноградной кислоты образуется аминокислота аланин.

Кроме того, аспарагиновая кислота может образовываться путем прямого аминирования фумаровой кислоты при участии фермента аспартазы.

Синтез аспарагиновой кислоты стимулируется светом и локализован главным образом в хлоропластах. Глутаминовая и аспарагиновая аминокислоты, присоединяя еще одну молекулу аммиака, дают амиды — глутамин и аспарагин.

Амидная группировка предохраняет глутаминовую и аспарагиновую кислоты от обратного отщепления аммиака при окислительном дезаминировании. Для того чтобы амиды образовались, необходимы затрата энергии (АТФ) и присутствие ионов магния. Реакция катализируется ферментом глутаминсинтетазой.

Образование аспарагина происходит аналогичным путем.

Для образования амидов особенное значение имеет возраст растений. Как правило, чем моложе растение, тем больше его способность к образованию амидов. В более молодых органах (листьях) и даже в более молодых клетках одного и того же органа образование амидов идет интенсивнее. В пасоке и в соке гуттации обычно присутствуют амиды. Это показывает, что аммиак, поступивший в растение, может преобразовываться в форму амидов в живых клетках корня.

В тех случаях, когда углеводов не хватает или интенсивность дыхания ослаблена, амиды не образуются и аммиак накапливается, в результате может наступить отравление растений. Относительное количество образовавшегося аспарагина и глутамина и их роль различны в зависимости от вида растений и условий среды. Все же, по-видимому, образование аспарагина преобладает в том случае, когда происходит распад белков в семенах. В клетках корня и листа растущего растения идет главным образом образование глутамина. Таким образом, аспарагин — форма обезвреживания аммиака, образовавшегося на пути распада белка (регрессивная ветвь азотного обмена), тогда как глутамин — форма обезвреживания аммиака, используемого на пути синтеза белка (прогрессивная ветвь азотного обмена).

Роль амидов в растении разнообразна. Это не только форма обезвреживания аммиака, это и транспортная форма азотистых соединений, обеспечивающая отток их из одного органа в другие. Наконец, чрезвычайно важно, что амиды и их непосредственные предшественники — глутаминовая и аспарагиновая кислоты — являются материалом для построения многих других аминокислот в процессах переаминирования, а также перестройки их углеродного скелета.

Из 20 аминокислот, входящих в состав белка (протеиногенных), только три, как мы видим, могут образоваться в процессе прямого аминирования. Остальные аминокислоты образуются в процессе переаминирования и взаимопревращения. Каждая из аминокислот, образовавшихся путем прямого аминирования (глутаминовая, аспарагиновая и аланин), является предшественником целой группы аминокислот. Реакции переаминирования были открыты в 1937 г. отечественными биохимиками А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман. При этих реакциях аминогруппа от указанных аминокислот обменивается с кетогруппой любой кетокислоты с образованием соответствующей аминокислоты. Эти реакции катализируются специальными ферментами — аминотрансферазами и идут при участии кофермента пиридоксальфосфата (производное витамина В₆):

R₁CHNH₂COOH + R₂COCOOH → R₁COCOOH + R₂CHNH₂COOH

Полученные путем переаминирования различные аминокислоты за счет перестройки углеродного скелета дают остальные аминокислоты. Таким образом, глутаминовая, аспарагиновая кислоты и их амиды являются как бы донаторами аминогруппы. Д. Н. Прянишников назы- вал их воротами, через которые должен пройти аммиак, для того чтобы включиться в остальные аминокислоты и белки.

Растительный организм, в отличие от животного, обладает способностью синтезировать все необходимые ему аминокислоты из неорганических соединений. В этом также выражается его автотрофность. Аминокислоты могут образовываться в разных органах растений — в листьях, корнях, верхушках стебля. Некоторые аминокислоты образуются непосредственно в хлоропластах и здесь используются на образование белка. Наиболее интенсивно синтез белка происходит в меристематических и молодых развивающихся тканях. Интересно, что в отрезанных листьях синтез белка полностью прекращается. Это служит еще одним доказательством, что для синтеза белка нужен какой-то фактор, образующийся в корнях растений. Можно предположить, что это фитогормон, относящийся к группе цитокининов.

Для нормального протекания синтеза белка в растительном организме нужны следующие условия: 1) обеспеченность азотом; 2) обеспеченность углеводами (углеводы необходимы и как материал для построения углеродистого скелета аминокислот, и как субстрат для дыхания); 3) высокая интенсивность и сопряженность процесса дыхания и фосфорилирования. На всех этапах преобразования азотистых веществ (восстановление нитратов, образование амидов, активизация аминокислот при синтезе белка и др.) необходима энергия, заключенная в макроэргических фосфорных связях (АТФ); 4) присутствие нуклеиновых кислот. ДНК необходима как вещество, в котором зашифрована информация о последовательности аминокислот в синтезируемой молекуле белка; и-РНК — как агент, обеспечивающий перейос информации от ДНК к рибосомам; т-РНК—как обеспечивающая перенос аминокислот к рибосомам; 5) рибосомы — структурные единицы, где происходит синтез белка; 6) белки-ферменты — катализаторы синтеза белка (аминоацил-т-РНК-синтетазы); 7) ряд минеральных элементов (ионы Mg²+, Ca²⁺).

Образованием белка заканчивается прогрессивная ветвь азотистого обмена в растениях, которая преобладает главным образом в молодых растущих органах (первичный синтез белковых веществ). Однако в растениях идет и непрерывный распад белка. Опыты с использованием меченого азота ¹⁵N позволили исследователю Ф. В. Турчину подтвердить последовательность включения азота в различные соединения, постулированную схемой Прянишникова (рис.1) и одновременно показать, что обновление белка происходит чрезвычайно быстро. За 48 ч до 60% белка организма синтезируется вновь. Вторая половина схемы Прянишникова показывает последовательность появления соединений в процессе распада белков (регрессивная ветвь азотистого обмена). Белки распадаются до аминокислот и далее до аммиака. Аммиак вновь обезвреживается в виде амидов (аспарагин и глутамин). На основе этих соединений образуются аминокислоты. Это позволяет организму синтезировать новый набор аминокислот, который обеспечит построение иных белков со своим специфическим набором и последовательностью аминокислот (вторичный синтез белковых веществ). Резюмируя все известные факты, Прянишников подчеркнул, что аммиак — это альфа и омега азотистого обмена в растениях, т. е. его начальный и конечный этапы. В условиях, обеспечивающих достаточно высокий уровень синтетических процессов, аммиак представляет собой прекрасный источник азотного питания для растений.

Признание аммиака как источника азотного питания имеет не только теоретическое, но и практическое значение. Получение удобрений, содержащих аммиачные соли,— процесс более простой и дешевый по сравнению с удобрениями, где азот содержится в форме нитратов.

В целом, оценивая сравнительное физиологическое значение аммиачных и нитратных форм азотных удобрений, необходимо учитывать следующее:

1. Аммиак как источник азотного питания имеет то преимущество, что он быстрее поступает и быстрее используется растением. Однако во избежание аммиачного отравления растения необходимо присутствие в нем достаточного количества углеводов. В силу этого применение аммиачных удобрений в рядки для культур с мелкими семенами не рекомендуется.

2. Накопление нитратов для растительного организма не представляет опасности. Однако при высоких дозах и накоплении нитратов в клетках растений они становятся весьма опасными для животных организмов, в том числе и для человека. Попадая в желудок, нитраты могут восстанавливаться до нитритов и далее при взаимодействии со вторичными аминами образовывать нитрозамин — вещество, обладающее сильным мутагенным действием. При этом необходимо учитывать, что повышенной способностью к накоплению нитратов при внесении удобрений обладают кормовые злаковые травы и некоторые овощные культуры. Считается, что предельно допустимая норма содержания нитратов в овощах не должна превышать 290—300 мг на 1 кг сырой массы. Предельно допустимое количество (ПДК) нитратов для человека составляет 500 мг в день. Это еще раз показывает необходимость строгого нормирования внесения питательных веществ с удобрениями.

3. Наконец, аммиачные и нитратные удобрения оказывают различное влияние на процессы обмена веществ и, как следствие, на качество урожая. При внесении аммиачных форм в растении накапливаются восстановленные соединения, тогда как при нитратных — окисленные. Так, было показано, что внесение аммиачных форм удобрений под махорку позволяет усилить накопление в ней никотина, тогда как внесение нитратов вызывает преимущественное образование органических кислот (А. В. Владимиров).

Опыты, проведенные в стерильных условиях, показали, что в качестве источника азотного питания могут быть использованы растениями и растворимые органические соединения (аминокислоты, амиды и мочевина). Однако их содержание в почве, как правило, очень мало. Для некоторых растений с уклоняющимся типом питания (паразиты, полупаразиты, сапрофиты, несекомоядные растения) источником питания может служить органический азот.

55. Использование молекулярного азота, современные представления о механизме восстановления молекулярного азота; организмы, осуществляющие азотфиксацию, их классификация, нитрогеназный комплекс, симбиотическая фиксация молекулярного азота.

Азот составляет около 1,5% сухой массы растений. Значение азота определяется тем, что он входит в состав важных органических соединений, таких, как белки, нуклеиновые кислоты, фосфолипиды. Азот входит в состав соединений группы порфиринов, которые лежат в основе хлорофилла и цитохромов, и многочисленных коферментов, в том числе НАД и НАДО, в состав гормонов роста, таких, как ауксины и цитокинины, а также во многие витамины. В связи с центральной ролью азота в метаболизме растительного организма вопросам азотного питания уделялось и уделяется большое внимание.

Формы азота в окружающей растения среде разнообразны: в атмосфере — газообразный азот и пары аммиака, в почве — неорганические формы азота (азот аммиака, аммония, нитратов, нитритов) и органические (азот аминокислот, амидов, белка, гумуса и др.). Такое разнообразие форм азота ставило перед исследователями вопрос об источниках азотного питания для растительного организма. В растениях соединения азота также находятся в разнообразной форме. В силу этого для понимания особенностей азотного питания требовалось установить основные этапы превращения его соединений. Данная проблема имеет исключительное практическое значение. Так, наиболее часто в естественных условиях растения встречаются с недостатком азота. Между тем рациональное применение азотных удобрений требует обязательного знания особенностей азотного обмена. Большая роль в выяснении всех указанных вопросов принадлежит работам академика Д. Н. Прянишникова и его учеников.

Французский ученый Буссенго установил, что при выращивании растений на прокаленном песке они содержат столько азота, сколько было в семени. Это показало, что высшие растения не могут усваивать азот атмосферы. Таким образом, несмотря на то, что в атмосфере содержится 80% азота, большинство растений не усваивают его. Однако есть растения, обогащающие почву азотом за счет атмосферы. К ним относится семейство Бобовых. Г. Гельригель установил, что на корнях бобовых растений образуются вздутия — клубеньки, заполненные живыми клетками бактерий. Эти бактерии живут в симбиозе с высшими растениями и фиксируют азот атмосферы. Дальнейшие исследования показали, что способностью фиксировать (усваивать) молекулярный азот атмосферы наделен ряд прокариотов.

ОСОБЕННОСТИ УСВОЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО АЗОТА

Процесс фиксации азота атмосферы имеет важное значение. Благодаря этому процессу азот переходит в формы, которые могут использовать все растительные, а через них и животные организмы. Организмы, способные к усвоению азота воздуха, можно разделить на: 1) симбиотические азотфиксаторы— микроорганизмы, которые усваивают азот атмосферы, только находясь в симбиозе с высшим растением; 2) несимбиотические азотфиксаторы - микроорганизмы, свободно живущие в почве и усваивающие азот воздуха. Наибольшее значение имеют симбиотические азотфиксаторы, живущие в клубеньках корней бобовых растений (клубеньковые бактерии), относящиеся к роду Rhizobium. Связывание азота атмосферы возможно только при симбиотической ассоциации микроорганизмов этого вида и высшего растения в основном из семейства бобовых. Существует большое количество видов и рас клубеньковых бактерий, каждая из которых приспособлена к заражению одного или нескольких видов бобовых растений. Корневые системы бобовых растений обладают специфическими корневыми выделениями. Благодаря этому клубеньковые бактерии скапливаются вокруг корневых волосков, которые при этом скручиваются. Через корневой волосок бактерии в виде сплошного тяжа, состоящего из соединенных слизью бесчисленных бактерий, проникают в паренхиму корня. Клетки перицикла начинают усиленно делиться. Возможно, бактерии выделяют гормон ауксин и именно это является причиной разрастания тканей, образуются вздутия — клубеньки. Клетки клубеньков заполняются быстро размножающимися бактериями, но остаются живыми и сохраняют крупные ядра. Клубеньковые бактерии заражают только полиплоидные клетки корня. Ткань клубеньков, заполненная бактериями, приобретает розовую окраску, так как после заражения там образуется пигмент, сходный с гемоглобином,— леггемоглобин. Этот пигмент связывает кислород воздуха и принимает непосредственное участие в усвоении азота. Исследования показали прямую зависимость между содержанием леггемоглобина и скоростью фиксации азота. При отсутствии леггемоглобина азот не усваивается. Информация об образовании леггемоглобина содержится в ДНК ядра клетки высшего растения. Однако он образуется после их заражения.

Взаимоотношения между высшими растениями и клубеньковыми бактериями обычно характеризуют как симбиоз. Однако на первых этапах заражения бактерии питаются целиком за счет высшего растения, т. е. практически паразитируют на нем. В этот период рост зараженных растений даже несколько тормозится. В дальнейшем азотфиксирующая способность бактерий увеличивается и они начинают снабжать азотистыми веществами растение-хозяина, вместе с тем бактерии получают от высшего растения углеводы. По мере дальнейшего развития наступает этап, когда высшее растение паразитирует на клетках бактерий, потребляя все образующиеся там азотистые соединения. В этот период часто наблюдается растворение (лизис) бактериальных клеток.

Благодаря деятельности клубеньковых бактерий часть азотистых соединений из корней бобовых растений диффундирует в почву, обогащая ее азотом. Высев бобовых растений ведет к повышению почвенного плодородия. Гектар бобовых растений в симбиозе с бактериями может перевести в связанное состояние от 100 до 200 кг азота за год. Значение этого трудно переоценить, если учесть, что азотные удобрения наиболее дорогие, а в почве соединения азота почти всегда в минимуме.

Существуют и другие виды высших растений, которые живут в симбиозе с бактериями, фиксирующими азот (ольха, лох и др.).

Большое значение имеют свободно живущие бактерии — азотфиксаторы. В 1893 г. русским микробиологом С. Н. Виноградским была выделена анаэробная азотфиксирующая бактерия Clostridium Pasteurianum. В 1901 г. голландский ученый М. Бейеринк выделил две аэробные азотфиксирующие бактерии — Azotobacter chroococum, Azotobacter agile. Сейчас известен ряд видов Azotobacter. Для того чтобы эти микроорганизмы осуществляли процесс фиксации азота, необходимо присутствие молибдена, железа и кальция. Особенно важно присутствие молибдена. Свободно живущие азотфиксаторы (Azotobacter) усваивают в среднем около 1 г азота на 1 м² в год. Усвоение атмосферного азота осуществляется также цианобактериями. В ряде стран их разведение практикуется на рисовых полях.

Конечным продуктом фиксации азота является аммиак. В процессе восстановления азота до аммиака участвует мультиферментный комплекс — нитрогеназа. Нитрогеназа состоит из двух компонентов. Один из них содержит молибден и железо (белок I), а другой — железо (белок II). Источником водорода и электрона для восстановления азота служит дыхательная электронно-транспортная цепь. Это указывает на связь усвоения азота атмосферы с процессами дыхания, а также фотосинтеза (источника углеводов). По современным представлениям электроны переносятся на азот с участием Мо и Fe, входящих в состав фермента нитрогеназы. Для восстановления N₂ до NH₃ требуется шесть электронов, и они расходуются в три этапа согласно уравнению:

N ΞN ^{2 e- + 2 H+}→HN =NH ^2e+2H+→H₂N – NH₂ ^{2 e -+ 2 H+}→2 NH₃

Процесс требует АТФ как источника энергии: для восстановления одной молекулы N₂ требуется не менее 12 молекул АТФ. Роль леггемоглобина заключается в поддержании концентрации О₂ на определенном уровне. В клетках высшего растения кислород необходим для поддержания дыхания. Однако в клетках бактерий для восстановления азота, и работы нитрогеназы нужны анаэробные условия. Оба эти условия и создаются леггемоглобином. Для образования леггемоглобина необходимы Fe, Си и Со. Для нормального протекания процесса азотофиксации необходимы Мо и Fe, поскольку они входят в состав фермента нитрогеназы.

Кобальт необходим в связи с тем, что он входит в состав витамина В12, который вовлекается в процесс биосинтеза леггемоглобина. Образовавшийся аммиак здесь же в клетках корня реагирует с α – кетоглутаровой кислотой с образованием глутаминовой кислоты, которая и вовлекается в дальнейший обмен. В надземные органы растения-хозяина азотистые вещества передвигаются главным образом в виде амидов (аспарагина, глутамина).

Как уже отмечалось, фиксирование атмосферного азота может осуществляться и рядом свободноживущих фотосинтезирующих организмов (сине-зелеными водорослями, серными бактериями). В этом случае донором водорода и электронов может быть или вода, или сероводород.

56. Основные соединения серы в растении, их роль в структурной организации клетки, участие в окислительно-восстановительных реакциях; источники серы для растений, механизм восстановления сульфатов, отдельные этапы процесса.

В почве находится в органической и неорганической формах. Органическая сера входит в состав растительных и животных остатков. Основные неорганические соединения серы в почве – сульфаты (CaSO₄, MgSO₄,Na₂SO₄). В затопляемых почвах сера находится в восстановленной форме в виде FeS, FeS₂ или H₂S.

Растения поглощают из почвы сульфаты и в очень незначительных количествах серосодержащие аминокислоты. Содержание серы в растениях составляет около 0,2 %. Однако в растениях семейства крестоцветных ее содержание значительно выше. Сера содержится в растениях в двух основных формах: окисленной (в виде неорганического сульфата) и восстановленной (аминокислоты, глутатион, белки). Процесс восстановления сульфата происходит в хлоропластах. Восстановление сульфатов – проявление автотрофного типа питания растений; у гетеротрофов не обнаружен.

Одна из основных функций серы в белках – это участие SH-группы в образовании ковалентных, водородных и меркаптидных связей, поддерживающих трехмерную структуру белка. Дисульфидные мостики между полипептидными цепями и двумя участками одной цепи (по типу S-S-мостика в молекуле цистеина) стабилизируют молекулу белка. Сера входит в состав важнейших аминокислот – цистеина и метионина, – которые могут находиться в растениях в свободной форме или в составе белков. Метионин относится к числу 10 незаменимых аминокислот и благодаря наличию серы и метильной группы обладает уникальными свойствами и входит в состав активных центров многих ферментов. Сера входит в состав многих витаминов и коферментов, таких, как биотин, коэнзим А, глутатион, липоевая кислота.