Вплив реакції середовища на активність ферментів
Вплив рН на активність амілази
Принцип реакції. За впливом рН на активність амілази визначають зміну інтенсивності забарвлення розчину крохмалю з йодом. Оптимум рН для амілази слини становить 6,8, в кислому та лужному середовищах активність амілази знижується.
Вплив рН на активність пепсину
Принцип реакції. Вплив рН на активність пепсину можна визначити за розщепленням цим ферментом білка фібрину за різних значень рН.
Вплив активаторів та інгібіторів на активність ферментів
Дія активаторів та інгібіторів на активність амілази
Принцип реакції. Активатором амілази є NaCl, а інгібітором- CuSО4. Вплив цих речовин на активність амілази визначають за ступенем гідролізу крохмалю під впливом ферменту за наявності NaCl і CuSО4.
Вплив жовчі на активність ліпази
Принцип реакції. Жовч містить поверхневоактивні солі жовчних кислот, які є активаторами ліпази. Жовч сприяє диспергуванню жирів із утворенням емульсії, що полегшує їх взаємодію як субстратів з ліпазою під час гідролітичних реакцій.
Специфічність ферментів
Специфічність дії амілази та сахарази
Принцип реакції. Амілаза розщеплює полісахарид крохмаль і не діє на дисахариди (мальтозу або сахарозу). Сахароза розщеплює тільки сахарозу й не розщеплює крохмаль та інші дисахариди.
Абсолютна специфічність дії уреази
Принцип реакції. Незначні зміни в структурі субстрату призводять до того, що фермент не впливає на цей субстрат. Так, субстратом для уреази є сечовина, а тіосечовина, яка відрізняється від сечовини наявністю атома сірки, уреазою не розщеплюється:
Групова специфічність дії сахарази
Принцип реакції. Сахараза специфічна щодо фруктозної частини дисахариду сахарози та трисахариду рафінози. Розщеплюється Р-глікозидний зв'язок, який розташований ближче до фруктозної частини згаданих молекул. Продукти ферментативного гідролізу сахарози та рафінози мають позитивну реакцію з реактивом Фелінга.
Визначення активності ферментів
Визначення активності амілази слини за методом Вольгемута
Принцип реакції. Метод Вольгемута ґрунтується на визначенні мінімальної кількості ферменту, яка здатна за певних умов повністю гідролізувати 1 мл 0,1%-го розчину крохмалю. Амілазна активність слини визначається кількістю 0,1 %-го розчину крохмалю, мл; яку може гідролізувати 1 мл нерозбавленої слини за температури 38 °С протягом 30 хв. У нормі амілазна активність становить 160-320. Метод Вольгемута широко застосовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності крові та сечі, в пивоварінні – солоду. Різке підвищення амілазної активності крові та сечі (в 10-30 раз) спостерігається при гострих панкреатитах, пухлинах підшлункової залози.
Методика визначення
1. У десять пробірок налити по 1 мл дистильованої води.
2. У першу додати 1 мл розведеної в десять разів слини.
3. Перемішати і 1 мл суміші перенести у другу пробірку.
4. Вміст цієї пробірки знову перемішати, 1 мл суміші перенести у третю пробірку й так до десятої.
5. З останньої пробірки відібрати 1 мл суміші й вилити. Таким чином, у кожній наступній пробірці вміст ферменту вдвічі менший, ніж у попередній і розведення слини в пробірках становитиме: 1:10, 1 : 20, 1 : 40, 1 : 80, 1 : 160, 1 : 320, 1 :640, 1 : 1280, 1 :2560, 1 :5120, 1 : 10240.
6. В усі пробірки додати по 1 мл води та по 2 мл розчину крохмалю, перемішати і поставити у термостат за температури 38 °С на 30 хв.
7. Після інкубації пробірки охолодити водопровідною водою для припинення дії ферменту, додати по дві краплини розчину йоду, добре збовтати і спостерігаати за зміною забарвлення. Під час реакції з йодом рідина забарвлюється в жовтий, рожевий та фіолетовий кольори.
8. Зазначити, за якого розведення відбувся повний гідроліз крохмалю з мінімальним вмістом ферменту (пробірка з жовтуватим забарвленням рідини). За кількістю нерозведеної слини (А) в цій пробірці розраховати амілазну активність слини (А мл слини розщеплює х мл 0,1%-го розчину крохмалю). Наприклад, жовтуватий колір з'явився в четвертій пробірці, де слина розведена в 160 разів. Цю кількість слини може гідролізувати 2 мл 0,1%-го розчину крохмалю, а 1 мл нерозведеної слини за подібних умов гідролізує 320 мл : х=ї-160/1. Отже, амілазна активність слини дорівнює 320.
Кількісне визначення лактатдегідрогенази
Принцип реакції. Метод ґрунтується на визначенні швидкості реакції під час перетворення лактату на піруват. Лактатдегідрогеназа каталізує зворотну окисно-відновну реакцію (за рН 10,0 рівновага реакції зміщується в бік перетворення лактату на піруват), де лактат втрачає два атоми водню:
Мірою активності ферменту є швидкість зростання екстинкції за λ 340 нм, оскільки спектри поглинання відновлених і окислених форм НАД різні.
Методика визначення
1. В дві пробірки вности по 0,1 мл розчину НАД+ 2 мл гліцинового буферу, 0,5 мл розчину DL-лактату, 1 мл дистильованої води.
2. В одну з них (досліджувана проба) додати 0,1 мл сироватки, а в другу (контрольна проба) – 0,1 мл води, перемішують і постамити у термостат на 30 хв. за 37 °С.
3. Реакцію припиняють, занурюючи проби в киплячу водяну баню на 3 хв.
4. Досліджувану пробу спектрофотометрвати за λ340 нм проти контрольної.
5. За допомогою секундоміра за екстинкцією зафіксувати, початок реакції (вимірювання повторюють кожні 30 с протягом 3 хв.). Збільшення оптичної щільності свідчить про утворення НАДН+ + Н+.
Активність лактатдегідрогенази визначають за збільшенням екстинкції (ΔЕ) на 0,001 в умовних одиницях і розраховати за формулою:
Е= ΔЕ-1000/t,
де E – активність ферменту, виражена в умовних одиницях екстинкції; ΔЕ – сума значень екстинкції, одержаних протягом 5хв. і виміряних із інтервалом 1 хв.; t – час, хв., інкубації; 1000—коефіцієнт для перерахунку на 100 мл сироватки крові.