Тема 3.3. Репарация ошибок и повреждений днк

1. Молекула ДНК постоянно подвергается разнообразным изменениям, вызванным действием различных веществ внешней и внутренней среды, радиацией и ультрафиолетовым облучением. Под влиянием этих факторов в структуре ДНК происходит:

•  дезаминирование оснований, при котором цитозин превращается в урацил, аденин - в гипоксантин, а гуанин - в ксантин. Чаще всего дезаминируется цитозин;

•  депуринизация, или депиримидинизация, результатом которой является появление в ДНК остатков дезоксирибозы, лишенных основания;

•  образование под действием ультрафиолета (УФО) пиримидиновых димеров между рядом расположенными в цепи основаниями;

•  разрыв нуклеотидных цепей;

•  появление ковалентных сшивок между цепями или цепями и гистонами;

•  возникновение ошибок репликации;

•  образование продуктов алкилирования ДНК (6-метилгуанина, 7-метил- гуанина, 3-метиладенина) под воздействием некоторых химических веществ.

2. Поврежденные основания ДНК обнаруживаются и удаляются ДНК- N-гликозилазами. Ферменты гидролитически расщепляют N-гликозидную связь между поврежденным основанием и остатком дезоксирибозы. Участки на молекуле ДНК, лишенные азотистого основания, получили названиеАП-сайтов (от англ. «apurinic» - apyrimidinic site). АП-сайты могут также

возникать в результате самопроизвольного гидролитического отщепления пуриновых или пиримидиновых оснований. Дальнейший ход репарации идет по одному из двух путей:

•  либо фермент ДНК-инсертаза может присоединять к дезоксирибозе основание в соответствии с правилом комплементарности;

•  либо эндонуклеаза определяет место повреждения (если это дезоксирибоза, лишенная основания, то фермент называют АП-эндонуклеазой) и гидролизует 3', 5'-фосфодиэфирную связь (рис. 3.8).

Рис. 3.8. Репарация эукариотической ДНК

Экзонуклеаза находит место разрыва цепи и удаляет поврежденный участок. ДНК-полимераза β присоединяется к З'-концу образовавшейся «бреши» и достраивает недостающий участок цепи (ликвидирует «брешь»). Матрицей служит неповрежденная цепь ДНК.

ДНК-лигаза соединяет неповрежденный и вновь синтезированный участки цепи ДНК.

3. Репарация возможна благодаря существованию двух цепей в молекуле ДНК - двух копий генетической информации. Если одновременно повреждается комплементарная пара нуклеотидов, репарация в гаплоидных клетках невозможна, а в диплоидных может идти за счет присутствия идентичного гена в гомологичной хромосоме.

Репарация необходима для сохранения генетического материала на протяжении всей жизни организма (сохранение структуры генома). Все ферменты постоянно активны и процесс идет непрерывно. Снижение активности ферментов репарации приводит к накоплению повреждений (мутаций) в ДНК.

Тема 3.4. Биосинтез рнк (транскрипция). Посттранскрипционные модификации рнк

1. Транскрипцией называется синтез РНК на ДНК-матрице. В результате образуются первичные траскрипты мРНК, тРНК, рРНК, комплементарные матричной цепи ДНК, имеющей направление от 3'-, к 5'-концу. Субстратами и источниками энергии для синтеза РНК являются рибонуклеозидтрифосфаты ( НТФ: АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ).

Катализируют синтез РНК ферменты РНК-полимеразы. В ядре клеток эукариотов обнаружены три фермента:

•  РНК-полимераза I, синтезирующая пре-рРНК;

•  РНК-полимераза II, ответственная за синтез пре-мРНК;

•  РНК-полимераза III, синтезирующая пре-тРНК.

В основе процесса лежит принцип комплементарности оснований в полинуклеотидной цепи матричной ДНК и синтезируемой РНК, когда против А встает U, против G - С, а против Т - А.

Суммарное уравнение синтеза РНК можно представить следующим образом:

2. Специфическая последовательность ДНК (сайт), в которой РНК-полимераза связывается с матрицей и начинает синтез РНК, называется промотором, а последовательность, на которой завершается синтез РНК, - сайтом терминации. Участок ДНК, ограниченный промотором и сайтом терминации, представляет собой единицу транскрипции -транскриптон. У эукариотов в состав транскриптона, как правило, входит только один ген.

Существование на молекуле ДНК множества транскриптонов позволяет с разной активностью проводить индивидуальное считывание (транскрипцию) разных генов. РНК-полимеразы - большие, олигомерные ферменты, состоящие из нескольких субъединиц и имеющие несколько центров связывания регуляторных факторов. В процессе транскрипции различают стадии инициации, элонгации и терминации (рис. 3.9).

3. «Активация» промотора происходит с помощью белка, который получил название ТАТА-фактора, потому что он взаимодействует со специфической последовательностью нуклеотидов промотора -ТАТА-. ТАТА-фактор облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Связывание РНК-полимеразы с промотором увеличивает сродство фермента к факторам инициации (А, В), которые обеспечивают раскручивание примерно одного витка двойной спирали ДНК.

Рис. 3.9. Стадии транскрипции:

1 - присоединение в область промотора белка, который называется «ТАТА-фактор»;

2 - включение РНК-полимеразы в промоторный участок, при этом в зоне присоединения РНК-полимеразы происходит локальное расплетение двойной спирали ДНК; 3 - рост нити пре-РНК; 4 - освобождение в сайте терминации пре-РНК и РНК-полимеразы из комплекса с ДНК ускоряют факторы терминации

Факторы элонгации (E, H, F) повышают активность РНК-полимеразы и облегчают локальное расхождение нуклеотидных цепей. Синтез молекулы РНК идет от 5 - к 3-концу на матричной цепи ДНК по принципу комплементарности и антипараллельности. По мере продвижения РНК-полимеразы по цепи ДНК в направлении от 3'- к 5'-концу впереди нее происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали.

Расхождение двойной спирали ДНК в области сайта терминации делает его доступным для факторов терминации. Когда РНК-полимераза достигает сайта терминации, транскрипция прекращается. Факторы терминации облегчают отделение первичного транскрипта от матрицы.

4. Посттранскрипционные модификации. Прежде чем выйти из ядра, каждый первичный транскрипт после ряда ковалентных модификаций превращается в «зрелую» молекулу РНК.

• Модификации пре-мРНК начинаются на стадии элонгации. Когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидов, происходит«кэпирование» 5'-конца. Остаток ГТФ присоединяется своим 5'-концом к 5'-концу фрагмента пре-мРНК с образованием 5'-, 5'-фосфодиэфирной связи. Последующее метилирование гуанина в составе ГТФ завершает образование «кэпа»:

где 7-метилгуанозинтрифосфат присоединен к 5'-концу первого нуклеотида (Х) в составе пре-мРНК.

По завершении транскрипции на 3'-конце первичного транскрипта мРНК специальным ферментом поли-А-полимеразой синтезируется поли-Апоследовательность, которая состоит из 100-200 остатков адениловой кислоты. Наличие поли-А-последовательности на 3'-конце облегчает выход мРНК из ядра и замедляет ее гидролиз в цитоплазме. Молекулы тРНК и рРНК не содержат «кэпа» и поли-А-последовательности.

Первичный транскрипт или пре-мРНК комплементарен гену, содержит как экзоны - последовательности, кодирующие определенные участки молекулы белка, так и интроны - некодирующие последовательности. В процессе образования молекул «зрелой» мРНК интроны вырезаются из первичного транскрипта, концы экзонов соединяются друг с другом - эту реакцию называют сплайсингом РНК (рис. 3.10).

Рис. 3.10. Сплайсинг пре-мРНК

Процесс вырезания интронов протекает при участии малых ядерных рибонуклеопротеинов (мяРНП), которые образуют комплексы - сплайсосомы.мяРНП состоят из малой ядерной РНК (мяРНК), связанной с белковым остовом, в который входит несколько протомеров. Отдельные мяРНП по принципу комплементарности узнают специфические последовательности интронов в первичном транскрипте, они катализируют реакцию расщепления 3', 5'-фосфодиэфирной связи на границе экзона с интроном и последующее соединение двух экзонов. После завершения сплайсинга «зрелая»

мРНК становится примерно в четыре раза короче первичного транскрипта. Сплайсинг происходит в ядре, в цитоплазму переносится уже «зрелая» мРНК (рис. 3.11). 

Рис. 3.11. Образование и выход из ядра зрелой мРНК

Модификации пре-тРНК. В процессе посттранскрипционных модификаций первичных транскриптов тРНК:

•  молекулы укорачиваются с 5'- и 3'-концов и удаляется интрон;

•  10-15% азотистых оснований в молекулах модифицируется;

•  на 3'-конце формируется акцепторный участок (-ССА) для присоединения аминокислот, а в средней части антикодон - триплет нуклеотидов, обеспечивающий взаимодействие тРНК с кодоном мРНК (рис. 3.12).

Рис. 3.12. Посттранскрипционные модификации пре-тРНК:

1 - удаляются участки полинуклеотидной цепи на 5'- и 3'-концах молекулы претРНК и интрон в центральной области молекулы; 2 - модифицируются азотистые основания (■), к 3'-концу присоединяется триплет-ССА; 3 - в цитоплазму выходят зрелые тРНК

Посттранскрипционные модификации пре-рРНК сопровождаются образованием из высокомолекулярного предшественника 28S, 18S и 5,8S «зрелых» рРНК, входящих в рибосому - органеллу клетки, участвующую в биосинтезе белка. В состав рибосом входят рРНК и белки, выполняющие структурную, регуляторную и каталитическую функции. Рибосома эукариотов (80S) состоит из двух (большой и малой) субъединиц - 60S и 40S (рис. 3.13). Величина S характеризует скорость оседания (седиментации) субъединиц рибосом при ультрацентрифугировании. Она пропорциональна молекулярной массе частиц. Рибосома прокариотов (70S) состоит из 50S и 30S. Рибосомы эукариотов и прокариотов различаются по молекулярной массе субъединиц, количеству рРНК, массе рРНК, количеству и разнообразию белков, способных

связывать специфические лиганды.

Рис. 3.13. Строение эукариотических рибосом