Тема 3.10. Использование рекомбинантных днк

В МЕДИЦИНЕ

Для изучения генетической неоднородности специфическую ДНК, содержащую информацию об интересующем нас гене или его фрагменте, необходимо выделить из соответствующего источника и получить в достаточном для исследования количестве. Ген или его фрагмент получают, используя:

•  обратные транскриптазы - ферменты ретровирусов, которые катализируют синтез ДНК на матрице мРНК;

•  химический синтез, позволяющий на автоматическом синтезаторе получать одноцепочечные фрагменты ДНК с заданной последовательностью и длиной до 100 нуклеотидов;

• рестриктазы - бактериальные ферменты из группы эндонуклеаз. Они «узнают» короткую специфическую последовательность нуклеотидов в ДНК длиной в 4-6, реже в 8-12 пар оснований и расщепляют обе нити. В настоящее время из бактериальных источников выделены сотни рестриктаз с разной субстратной специфичностью. Расщепление обеих нитей ДНК может происходить двояким путем - с образованием двухцепочечных («тупых») или одноцепочечных («липких») концов. Синтез рекомбинантных ДНК. Образованные с помощью рестриктаз фрагменты гена, имеющие «липкий» конец, могут по принципу комплементарности взаимодействовать с «липким» концом другого, не родственного ему фрагмента ДНК, который может принадлежать бактериофагу, вирусу или плазмиде и получаться при действии на ДНК той же самой рестриктазы (рис. 3.27). Фрагменты ковалентно соединяют друг с другом с помощью фермента ДНК-лигазы и получают рекомбинантные (или гибридные) ДНК.

Рис. 3.27. Образование молекул рекомбинантной ДНК с помощью рестриктаз и ДНКлигазы:

ДНК Х и ДНК Y - две молекулы ДНК из различных источников; Eco RI - бактериальная рестрикционная эндонуклеаза

Клонирование ДНК. Методика клонирования и размножения рекомбинантной ДНК в бактериях позволяет получить интересующие нас продукты: ДНК, РНК или белки в достаточно больших количествах (рис. 3.28). Бактериофаги, бактериальные плазмиды - экстрахромосомные кольцевые ДНК - используются в качестве векторов, с помощью которых чужеродный ген вносится в бактерию, где обеспечивается его репликация, транскрипция и трансляция с образованием нужного белкового продукта.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации, т.е. получения большого числа копий интересующего нас гена или его фрагмента в условиях in vitro. Реакционная смесь для получения интересующей нас ДНК содержит: исследуемую ДНК-матрицу, субстраты реакции - четыре дНТФ (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ), два праймера, термостабильную Taq-полимеразу и реакционный буфер, содержащий ионы Mg²+ в качестве кофактора.

Праймеры - это искусственно синтезированные короткие однонитевые ДНК (20-30 нуклеотидов), выполняющие функцию «затравок» при ферментативном синтезе ДНК. В ПЦР обычно используют два праймера, которые комплементарны 3'-концевым последовательностям амплифицируемого участка на обеих нитях ДНК-матрицы соответственно. Концентрация праймеров значительно превышает количество ДНК-матрицы в реакционной смеси. Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых в ПЦР фрагментов ДНК.

В один цикл ПЦР включается три этапа (рис. 3.29):

•  денатурация - исходная смесь нагревается до 94 °С, при этом имеет место разрушение двуспиральной структуры ДНК и расхождение цепей;

•  отжиг - на этом этапе температура реакционной смеси снижается до 52-60 °С и происходит комплементарное связывание праймеров с нитями матричной ДНК;

•  полимеризация, в ходе которой Taq-полимераза катализирует удлинение праймеров (с 3'-конца) и синтез новых цепей ДНК. Температура смеси для проявления оптимальной активности Taq-полимеразы соответствует 72 °С.

Эти этапы повторяются многократно в автоматическом приборе - амплификаторе (термоциклере), что позволяет получить огромное количество копий интересующего нас фрагмента ДНК. Так, в результате проведения 20 циклов ПЦР анализируемый участок ДНК амплифицируется более чем в миллион раз. Продолжительность каждого этапа цикла ПЦР определяется экспериментально и обычно длится 1-2 минуты.

Механизм образования рекомбинантных ДНК дает возможность:

•  использовать микроорганизмы в качестве продуцентов необходимых для человека веществ: белковых гормонов (инсулин, гормон роста, соматостатин), биологически активных пептидов, вакцин (например, против гепатита С), факторов, участвующих в свертывании крови (фактор VIII для лечения гемофилии);

•  создавать новые полезные для человека формы растений и животных;

•  предпринимать попытки лечения наследственных болезней путем введения в клетки нормальных копий дефектных генов.

Рис. 3.28. Клонирование ДНК в бактериальных клетках

Рис. 3.29. Полимеразная цепная реакция

Благодаря использованию методов клонирования ДНК удается решать вопросы генетического картирования (т.е. составления генетической карты организма), установления хромосомной локализации многих генетических нарушений, таких, как серповидноклеточная анемия (11-хромосома), фенилкетонурия (12-хромосома), мышечная дистрофия Дюшена (10-я хромосома) и др., проводить пренатальную диагностику наследственных заболеваний.

Использование техники рекомбинанатных ДНК для диагностики и лечения заболеваний

Полиморфизм длины рестрикционнных фрагментов. Замены, делеции и вставки нуклеотидов вызывают изменения в первичной структуре ДНК, а следовательно, и в расположении сайтов рестрикции. После обработки рестриктазами мутированной ДНК образуются фрагменты иного размера, чем в случае анализа нормальной ДНК. Этим пользуются при обследовании пациентов на носительство патологических генов (в частности, при обследовании семей, в которых родители являются гетерозиготами по гену серповидноклеточной анемии).

Определение мутаций с помощью аллель-специфических проб. Синтезируются два коротких олигодезоксинуклеотида, меченных изотопом Р³², один из которых содержит ДНК-последовательность, включающую мутацию, а другой не изменен. С помощью этих аллель-специфических проб ДНК пациентов проверяют

на носительство исследуемой мутации. Для этого область гена, содержащая интересующий нас участок, амплифицируется с помощью ПЦР. Образцы наносят на узкие полоски нитроцеллюлозы и обрабатывают мечеными олигонуклеотидами, содержащими нормальную или мутантную последовательность. Радиоавтографически оценивают, с какой из проб преимущественно связывается ДНК пациента.

Генная терапия. Основная цель этого направления - терапия наследственных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения в клетки пациентов генов, устраняющих генные дефекты или придающие им новые функции. Впервые эта задача была решена в 1990 г., когда четырехлетней девочке, страдающей наследственным иммунодефицитом, вызванным мутацией в гене аденозиндезаминазы (АДА), были пересажены ее собственные лимфоциты с предварительно введенным in vitro ретровирусным ДНК-вектором, содержащим нормальный ген АДА. К настоящему времени подобным способом пытаются лечить некоторые наследственные, онкологические заболевания и ВИЧ-инфекции.

С 1990 г. ученые всего мира участвуют в международном проекте «Геном человека», цель которого заключается в выяснении последовательности нуклеотидов во всех молекулах ДНК клеток человека с одновременным установлением локализации всех генов. Решение поставленных задач станет возможным благодаря внедрению новейших технологий второго и третьего поколений.

Из почти 10 000 различных заболеваний человека 3 000 - наследственные. Они не обязательно должны быть наследуемыми и передаваться от поколения к поколению. В этом контексте слово «наследственные» означает, что причина болезни заключается в повреждении наследственного аппарата. В настоящее время сотни генов, повреждение в которых вызывает болезнь, полностью секвенированы. Ожидается, что будут изучены все гены, вовлеченные в развитие патологических процессов у человека. Это поможет вывести на новый уровень методы ранней диагностики и лечения заболеваний.

МОДУЛЬ 4 СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

_Темы_

4.1. Общая характеристика мембран. Строение и состав мембран

4.2. Транспорт веществ через мембраны

4.3. Трансмембранная передача сигналов_