1.4. Выделение, фракционирование и очистка белков
1.4.1. Выделение белков
Выделение белков из животных и растительных тканей состоит из нескольких этапов:
Консервирование сырья – быстрое замораживание при -10 о С и ниже, лиофильная сушка (сушка под вакуумом) для сохранения белков.
Измельчение сырья – разрушение клеточных структур, в которых находятся белки микроизмельчителем, ультразвуком, многократным замораживанием и оттаиванием.
Экстракция – выход белков из измельченного сырья в растворитель. Растворитель: воду, солевой раствор, спирт и др. подбирают в зависимости от растворимости белка (см.п.1.5.1).
Выделение водорастворимых белков из мышечной ткани представлено на рис. 8.
Рис 8. Схема выделения водорастворимых белков из мышечной ткани
1.4.2. Фракционирование и очистка белков
Фракционирование и очистка белков основаны на различиях в их физико-химических свойствах: молекулярной массе, растворимости, изоэлектрическом состоянии, высаливании и др. К методам фракционирования и очистки белков
относятся:
Высаливание – белки ступенчато осаждают из раствора добавлением различных концентраций насыщенных растворов нейтральных солей, характерных для каждого белка.
Изоэлектрическое осаждение – белки последовательно осаждают из раствора изменением изоэлектрической точки-pI, характерной для каждого белка путем добавления кислого или щелочного буфера.
Осаждение органическими растворителями – белки последовательно осаждают путем добавления разных, но невысоких (4-8 %-ных) концентраций спирта или другого органического растворителя при низких температурах (+4 о С).
Ионнообменная хроматография – разделение белков на колонках с ионообменными смолами: ионитами, основанное на электрохимических свойствах белков, способности их к ионизации. Разделяемые белки соединяются с кислыми или щелочными группами ионитов ионной связью с различной силой в зависимости от заряда белка и затем последовательно вымываются буферными растворами с различным рН.
Гель-фильтрация – метод разделения и очистки белков, основанный на различии в молекулярной массе белков. Осуществляется на колонках с гелем полисахарида декстрана с определенным размером пор. Белки с большой молекулярной массой проскакивают между гранулами геля и вымываются из колонки первыми, а низкомолекулярные белки или примеси входят в поры геля и поэтому выходят последними (рис. 9).
Рис. 9 . Схема разделения белков гель-фильтрацией: А – смесь нанесена
на колонку; Б – середина процесса; В – крупные молекулы выхо-
дят из колонки первыми
Метод гель-фильтрации также применяют для определения молекулярной массы разделенных белков, заранее построив график зависимости величины молекулярной массы выбранных стандартных белков от их объемов, выходящих из колонки.
Электрофорез – разделение белков основано на различной скорости перемещения белков в электрическом поле, что определяется их разным зарядом (рис. 10). Величина заряда белка зависит от его аминокислотного состава, то есть от количества положительно или отрицательно заряженных функциональных групп аминокислот.
Рис. 10 . Схема электрофореза белков в полиакриламидном геле (ПАГ)
Диализ – метод разделения и очистки белков от низкомолекулярных примесей, основан на явлении осмоса и неспособности крупных молекул белка проходить через поры полупроницаемых мембраны. За счет разности осмотических давлений и внутри диализатора низкомолекулярные частицы, например соли, выходят из диализатора, а белки остаются внутри его.
Диализом можно разделить водорастворимые и солерастворимые белки. Так как солерастворимые белки нерастворимы в дистиллированной воде, то по окончании диализа они выпадают в осадок.
После разделения и очистки проверяют чистоту выделенного белка. Для этой цели, используя различные физико-химические методы, определяют для выделенного и очищенного белка:
- температуру кипения и плавления;
- удельный вес;
- показатель преломления;
- молекулярную массу;
- наличие характерных функциональных групп, например СООН-групп;
- растворимость;
- электрофоретическую подвижность;
- однородность вещества