6.2. Кариотип человека
Хромосома - это самовоспроизводящийся структурный элемент ядра клетки. Число, размер и форма хромосом строго определены и специфичны для каждого вида. Термин "хромосома" был предложен в 1888 W. Waldeyer. Каждая хромосома состоит из одной или нескольких пар хроматиновых нитей. Морфологию хромосом эукариот определяют на стадии метафазы митоза. Характерные для вида особенности хромосом (то есть их количество, размеры, форма, наличие спутников и т.д.) называют кариотипом.
При анализе кариотипа хромосомы располагают в виде идиограммы. Идиограмма – это систематизированный кариотип, т.е. хромосомы располагаются попарно по мере убывания их величины, с учётом положения центромеры, наличия вторичных перетяжек и спутников (рис. 6.5). Половые хромосомы выделяют особо. У человека длина хромосом составляет от 1,5 до 10 мкм.
В объеме интерфазного ядра каждое плечо хромосомы располагается в определенной зоне, объем которой не перекрывает объем соседних хромосом, хотя они примыкают друг к другу. Каждая из хромосом в нескольких местах связана с ядерной оболочкой. Все теломерные участки фиксированы на ядерной мембране на одном полюсе интерфазного ядра; на противоположном полюсе ядра располагаются (тоже фиксированные на мембране) центромерные районы хромосом.
Рисунок 6.5. Идиограмма хромосом человека
В последнее время показано, что в нормальных клетках богатые генами хромосомы располагаются ближе к центру ядра, а бедные генами хромосомы – на периферии ядра. Например, хромосом 18 и 19. Материал хромосомы 19, богатой генами, тяготеет к внутреннему компартменту ядра, тогда как территория хромосомы 18, бедной генами, находится на его периферии. Область, прилежащая к ядерной оболочке, и области, прилежащие к конститутивному (н-р, прицентромерному) гетерохроматину, являются в ядре неактивными компартментами. Простое перемещение генов в эти компартменты приводит к их долговременной инактивации. Пример: в эритроидных клетках глобиновые гены располагаются далеко от конститутивного гетерохроматина, тогда как в неэритроидных клетках они практически контактируют с конститутивным гетерохроматином.
Каждая хромосома имеет первичную перетяжку или центромеру, которая делит хромосому на два плеча (рис. 6.7.). Участок центромеры ответственен за контакт с микротрубочками веретена деления и перемещения хромосомы при клеточном делении. К центромерной ДНК присоединяются центромерные белки, образующие кинетохор. Это справедливо для хромосом с локализованной центромерой.
В центромерных районах хромосом локализована сателлитная ДНК, т.е. высоко повторяющиеся последовательности ДНК. Центромерная ДНК S. cerevisiae состоит из повторяющихся участков по 110 п.н. Она имеет по 2 консервативных участка (1 и 3) и центральный элемент (2), обогащённый АТ. У мыши – основной класс стДНК – повтор последовательности в 234 п.н.
ДНК центромерного участка хромосом человека представлена блоком тандемно организованных повторяющихся единиц размером 171 пн. Тяжи мономеров включают до 3 млн. пн. В середине тяжа идентичность копий мономеров составляет 99%, а на концах тяжа единицы мономеров более дивергированы. Характер организации центромер человека и арабидопсиса сходен, хотя первичные последовательности их мономеров совершенно различны.
В центромерном хроматине эукариот обнаружены видоспецифические варианты гистона Н3 – CENP-A у человека и CENH3 у растений. Предполагается, что именно CENH3, взаимодействуя другими гистонами Н2А, Н2В, Н4 формирует и определяет специфический тип нуклеосом, которые присутствуют только в функционирующих центромерах. Возможно, что такие нуклеосомы являются "якорями" для образования кинетохора.
В организации центромерного хроматина определенную роль могут играть малые РНК. Показано, что пул специфических для центромер малых РНК (40-200 пн) транскрибируется с центромерного ретротранспозона и сателлитной ДНК, связан с центромерным гистоном Н3 в пределах комплекса кинетохора кукурузы.
Сформированный кинетохор представляет собой трехслойную структуру: внутренний слой (40-60нм), светлоокрашенный средний слой (25-30 нм) и внешний слой (40-60 нм). Внутренняя поверхность кинетохора взаимодействует с центромерным хроматином. Микротрубочки, связанные с кинетохором, контактируют с его внешним слоем.
В зависимости от расположения центромеры выделяют метацентрические, субметацентрические и акроцентрические хромосомы. Для акроцентрических хромосом характерно наличие вторичной перетяжки, отделяющей спутники. Данный участок хромосомы содержит большое количество генов рРНК. Гены рРНК часто образуют тандемные пары, которые организованы в кластеры. Каждый кластер тандемно повторяющихся генов рРНК соответствует ядрышковому организатору.
Теломеры – концевые структуры линейных хромосом, состоящие из повторяющихся последовательностей ДНК. У человека теломерные участки хромосом образованы тысячами повторов последовательности TTAGGG. Среди растений наиболее часто в теломерах повторяется последовательность TTTAGGG. Известно, что растения семейства луковичных имеют иные теломерные последовательности. Теломерные последовательности у Sacharomyces cerevisia представляют собой вариабельные повторы TG. У дрожжей теломера находится в ненуклеосомном хроматине, защищённом от действия нуклеаз, и называется телосомой.
Теломерные районы хромосом имеют общие с гетерохроматином свойства, в том числе: наличие высокоповторяющихся последовательностей, способность образовывать ассоциаты, инактивация генов, попавших в зону гетерохроматина или теломерного хроматина.
Теломеры хромосом собраны в несколько кластеров, которые располагаются по периферии ядра. Предполагают, что теломерные последовательности заякориваются на ядерной оболочке с помощью ДНК-белковых взаимодействий. Кроме того, теломеры взаимодействуют друг с другом. При этом плечи хромосом никогда не переплетаются. Ещё в 30-е годы Барбара Мак-Клинток показала, что теломеры защищают хромосомы от деградации и препятствуют слипанию хромосом.
Сейчас известно, что в результате "концевой недорепликации" в 3-нити молекулы ДНК образуется одноцепочечный конец, который специфическим образом сворачивается и взаимодействует с двунитевым районом теломеры, образую Т-петлю. Т-петля стабилизируется белковыми факторами. Этот процесс обеспечивает защиту молекулы ДНК от экзонуклеаз и называется кэппингом. Нарушение кэппинга может приводить к теломерным слияниям плеч хромосом. Нарушение кэппинга теломер распознается как разрыв, который должен репарироваться. Это приводит к теломера-теломерному слипанию хромосом с образованием дицентриков.
Специфические элементы теломер необходимы для расхождения сестринских хроматид в митозе. На Tetrachymena показано, что введение мутации в последовательность теломерного повтора блокирует расхождение хроматид в анафазе митоза. Предполагают, что теломеры сестринских хроматид соединены друг с другом на протяжении G2 – фазы клеточного цикла и в митозе до метафазы включительно. Ассоциаты теломер создаются с помощью теломерсвязывающих белков. В норме ассоциаты теломер должны распадаться перед расхождением хроматид в анафазе. Возможно, что при мутации в теломерной ДНК изменяется узнавание теломерного комплекса топоизомеразой 2. Этот фермент необходим для разделения хромосом в анафазе.
Теломеры необходимы для начала репликации ДНК: к ним прикрепляется РНК-затравка, с которой на каждой из нитей двойной спирали ДНК начинается синтез нити, комплементарной первой. После каждого деления клетки часть концевых нуклеотидов на каждой из вновь образованных хромосом безвозвратно теряется вместе с РНК-затравкой. При каждом цикле репликации дочерняя цепь ДНК теряет часть повторов теломеры -8-16 нуклеотидов. Предполагают, что как только теломеры укорачиваются ниже некой критической длины, происходит остановка клеточного цикла и старение клетки. Предложена модель старения, которая основывается на том, что гены, расположенные рядом с теломерой, подвергаются нестабильной транскрипционной репрессии. Предполагают, что транскрипция локуса "AGE" также подавлена благодаря теломерному эффекту положения. По мере старения клеток и укорочения теломер эта репрессия снимается и данный локус становится транскрипционно активным.
Наличие постоянно делящихся клеток у животных, тотипотентность растительных клеток предполагает, что они должны либо поддерживать, либо синтезировать полный комплемент теломерных повторов. В 1971 году Оловников предположил существование особого механизма, предотвращающего недорепликацию линейных молекул ДНК прежде всего в половых и раковых клетках, в тоже время данный механизм не действует в большинстве соматических клетках.
Грэйдер и Блэкберн на Tetrachymena впервые в 1985 году обнаружили рибонуклеопротеидный фермент, названный теломеразой. Фермент достраивает 3-конец теломер, т.е. удлиняет их. В состав фермента входит РНК – субъединица, содержащая короткую матричную последовательность РНК, комплементарную теломерной ДНК. Длина теломеразной РНК колеблется от 150 нуклеотидов у простейших до 1400 у дрожжей и 450 у человека. На последних этапах удвоения хромосом теломераза присоединяется к началу обреченного на гибель участка ДНК, достраивает небольшой отрезок из комплементарных ему нуклеотидов, передвигается на шаг к концу хромосомы – и так до тех пор, пока не восстановит исходную длину теломеры. Таким образом, теломераза – это обратная транскриптаза.
Вторую, комплементарную нить концевого участка ДНК достраивают ДНК-полимераза и остальной комплекс ферментов, за счет которых происходит удвоение нитей ДНК при делении клетки. Теломеразная активность необходима для поддержания теломер в пролиферирующих клетках. У человека это клетки плода, стволовые клетки костного мозга, клетки семенников, эпидермиса кожи.
Клетки имеют систему гомеостаза теломерной длины, которая включает работу теломеразы и механизм проверки теломерной длины. В контроле длины теломер участвует белок Rap 1 (у млекопитающих – TRF 1 ), который специфически связывается с теломерными повторами. Число молекул данного белка на теломере является сигналом аппарату регуляции длины теломер. Например, у дрожжей в теломерах в среднем на каждые 20 оснований TG-последовательности встречается Rap1 – связывающий мотив. Rap1, связываясь с крайним повтором, ограничивает доступ теломеразы к концу хромосомы, следовательно не происходит удлинения теломерной ДНК. Согласно другому предположению Rap1-белок прямо взаимодействует с теломеразой и негативно регулирует работу фермента.
Длина теломер является величиной, характерной для вида. У млекопитающих она колеблется от 5 до нескольких десятков тпн. Но в некоторых случаях (инбридинг, опухолевая трансформация) размер теломер может резко изменяться (как увеличиваться, так и уменьшаться). Длина теломер может изменяться в зависимости от стадии развития.
Кариотип человека. Все хромосомы человека разделены на несколько групп (рис. 6.5.). Группа А включает хромосомы 1-3. Первая пара хромосом является самой большой в кариотипе человека. По морфологии – это метацентрические хромосомы. Вторая пара хромосом – самые большие субметацентрики в кариотипе человека. Хромосома 3 является крупным метацентриком, который на 20% меньше первой хромосомы.
Группа В включает хромосомы 4 и 5 – это большие субметацентрические хромосомы. Группа С – самая большая по числу хромосом. В нее относятся средние по размеру субметацентрические хромосомы (с 6 по 12 пары хромосом). Группа хромосом D – 3 пары больших акроцентрических хромосом, имеющих вторичную перетяжку (13 – 15 пары хромосом). К группе E относятся три пары небольших субметацентрических хромосом (16 – 18 хромосомы). Две пары маленьких метацентрических хромосом (19 и 20) отнесены в группу F. Последняя группа аутосомных хромосом – группа G – самые маленькие в кариотипе хромосомы – акроцентрики 21 и 22.
Половые хромосомы
Половые хромосомы, в отличие от аутосом, обозначаются не порядковыми номерами, а буквами X, Y, причём отсутствие хромосомы обозначается цифрой 0. У человека, как и у большинства млекопитающих, гомогаметный пол - женский (XX), гетерогаметный пол - мужской (XY) (рис. 6.10).
На стрекозах показано, что форма XY эволюционно более поздняя, чем ХО. Другая точка зрения - половые хромосомы произошли от обычной пары аутосом, несущей гены, определяющие пол. Поэтому у одних видов (более примитивных) Y-хромосома такая же по размерам, как и Х–хромосома, конъюгирует с ней полностью или частично, участвует в кроссинговере. А у других видов – она маленькая, с Х-хромосомой соединяется конец в конец, без кроссинговера. В процессе эволюции Y- хромосома почему-то теряет активные гены, деградирует и исчезает, потому форма XY предшествует ХО.
Х-хромосома человека по морфологии соответствует хромосомам группы С, то есть является субметацентриком средних размеров и несет достаточно большой набор генов, в том числе и обуславливающих ряд наследственных заболеваний (рис. 6.10).
Y -хромосома
Y-хромосома – самая вариабельная хромосома генома. У человека она генетически почти пустая (ген волосатости ушей и перепонок между пальцами ног). У других видов может содержать много активных генов – у гуппи – около 30 Y–генов окраски самцов (и только 1 аутосомный ген).
Y-хромосома является наименьшей по размеру из 24 хромосом у человека и содержит около 2-3% ДНК гаплоидного генома, составляя приблизительно 51 Mb. Из всего объема ДНК Y-хромосомы на данный момент секвенировано 21.8 Mb. Короткое плечо Y-хромосомы (Yp) содержит примерно 11 Mb, а длинное плечо (Yq) - 40 Mb ДНК, из которых около 7 Mb приходятся на эухроматиновую часть Yq и около 3 Mb ДНК на центромерную область хромосомы. Большая часть (~60%) длинного плеча Y-хромосомы представляет собой функционально неактивный гетерохроматин, имеющий размер около 24 Mb. В Y-хромосоме выделяют несколько областей: псевдоаутосомные области (PARs); - эухроматиновую область короткого плеча (Yp11); - эухроматиновую область проксимальной части длинного плеча (Yq11); - гетерохроматиновую область дистальной части длинного плеча (Yq12); - область прицентромерного гетерохроматина (рис. 6.12).
Y-хромосома содержит около 100 функциональных генов. Из-за наличия на Х и Y-хромосомах (на теломерах) гомологичных PAR-регионов, половые хромосомы регулярно конъюгируют и рекомбинируют участками этих регионов в зиготене и пахитене профазы I мейоза. Однако большая часть (~95%) Y-хромосомы не принимает участия в рекомбинации, и поэтому называется нерекомбинирующей областью Y-хромосомы (NRY - Non Recombinant Region Y chromosome).
Гетерохроматиновая область длинного плеча Y-хромосомы является генетически инертной и содержит различные типы повторов, в том числе высокоповторяющиеся последовательности двух семейств DYZ1 и DYZ2, каждый из которых представлен приблизительно 5000 и 2000 копиями соответственно.
На основе сравнительного анализа генов гоносом X и Y в Y-хромосоме выделяют три группы генов:
PAR-гены (PAR - Pseudoautosomal Region; гены псевдоаутосомных областей PAR1 и PAR2), локализованные в теломерных областях Y-хромосомы;
X-Y гомологичные гены, локализованные в нерекомбинирующих областях Yp и Yq;
Y-специфичные гены, расположенные в нерекомбинирующих областях Yp и Yq.
Первая группа представлена генами псевдоаутосомных областей (регионов). Они являются идентичными для X- и Y-хромосом и наследуются как аутосомные гены. PAR1-регион расположен на конце короткого плеча Y-хромосомы, он больше по размеру, чем PAR2-регион, локализованный на конце длинного плеча Y-хромосомы, и его размер приблизительно оценивается в 2,6 Mb. Так как делеции PAR1 приводят к нарушениям конъюгации гоносом во время мейоза у мужчин и могут привести к мужскому бесплодию, предполагается, что PAR-регионы имеют существенное значение для нормального протекания сперматогенеза у мужчин.
Вторая группа генов содержит X-Y-гомологичные, но не идентичные гены, которые локализованы в нерекомбинирующих районах Y-хромосомы (на Yp и Yq). В нее включены 10 генов, представленных на Y-хромосоме одной копией, большинство из них экспрессируются у человека во многих тканях и органах, включая яички и предстательную железу. До сих пор неизвестно, являются ли эти X-Y-гомологичные гены функционально взаимозаменяемыми.
Третью группу генов составляют 11 генов, которые расположены в нерекомбинирующем районе Y-гоносомы (NRY). Все эти гены, за исключением гена SRY (Sex-Determining Region Y Chromosome, пол-детерминирующий регион Y-хромосомы), представленного одной копией, являются мультикопийными, и их копии расположены на обоих плечах Y-хромосомы. Некоторые из них являются генами-кандидатами на AZF-фактор (Azoospermia factor, или фактор азооспермии).
О точных функциях большинства этих генов известно мало. Продукты, кодируемые генами нерекомбинирующего региона Y-хромосомы, выполняют различные функции, например, среди них имеются факторы транскрипции, цитокиновые рецепторы, протеинкиназы и фосфатазы, которые могут влиять на клеточную пролиферацию и/или передачу сигналов в клетке.
На длинном плече Y-хромосомы расположен AZF (Azoospermia Factor) локус – содержит гены, контролирующие процесс дифференцировки половых клеток, т.е. сперматогенез. В данном локусе выделяют 3 региона – a (800 т.п.н.), b (3,2 млн пн), c (3,5 млн. пн). Микроделеции участков данного локуса являются одной из основных генетических причин мужского бесплодия. Микроделеции длинного плеча Y-хромосомы обнаруживаются у 11% мужчин с азооспермией и у 8% мужчин с олигозооспермией тяжелой степени. При делеции всего с-региона AZF локуса возможно возникновение блока в митозе и мейозе при сперматогенезе; на гистологических препаратах у таких больных в большинстве семенных канальцев отсутствуют половые клетки.
Для Y-хромосомы характерны специфические черты, резко отличающие ее от других хромосом человека: 1) обедненность генами;
2) обогащенность повторяющимися блоками нуклеотидов. Присутствие значительных гетерохроматиновых районов;
3) наличие области гомологии с Х-хромосомой - псевдоаутосомальной области (PAR) (Черных, Курило, 2001).
Y-хромосома, как правило, не велика - 2-3% гаплоидного генома. Тем не менее, кодирующей способности ее ДНК у Homo sapiens достаточно по крайней мере для нескольких тысяч генов. Однако у этого объекта в Y-хромосоме выявляется всего около 40 обогащенных ГЦ-парами так называемых ЦрГ-островков, обычно фланкирующих большинство генов. Реальный же список генетических функций, связанных с этой хромосомой, вдвое меньше. Фенотипическое влияние этой хромосомы у мышей ограничено весом тестисов, уровнем тестостерона, серологического HY-антигена, чувствительностью органов к андрогенам и сексуальным поведением. Большая часть генов этой хромосомы имеет X-хромосомные аналоги. Большинство Y-хромосомных последовательностей гомологичны ДНК Х-хромосомы или аутосом и лишь часть из них строго уникальна.
Наличие псевдоаутосомальных областей, обеспечивающих мейотическое спаривание и рекомбинацию, обычно рассматривается как необходимое условие фертильности. Интересно, что размер участка мейотического спаривания существенно длиннее PAR. У человека имеются два псевдоаутосомальных района на вершине короткого и длинного плеч Х-хромосомы. Однако, только для первого из них установлены облигатный обмен в мейозе, наличие хиазм, влияние на фертильность.
Высказано предположение о происхождении половых хромосом млекопитающих от предковой аутосомы в результате независимых циклов: добавление - рекомбинация - деградация. PAR, по такой терминологии, представляет собой лишь как бы реликт такого последнего добавления. Далее происходят деградация и потеря соответствующих Y-хромосомных частей и инактивация Х-хромосомы. Все гены, представленные в Y-хромосоме, или имеют реальную селективную ценность (например, SRY), или находятся на пути исчезновения. Каждый Y-хромосомный ген, быстро дивергирующий, амплифицирующийся или склонный к исчезновению, имеет своего гомолога в Х-хромосоме, более консервативного и активного у обоих полов. Так, Sox3, предполагаемый X-хромосомный гомолог SRY, кодирует почти идентичные продукты у человека, мыши и сумчатых, экспрессируется в нервной системе обоих полов. SRY быстро дивергирует и активен только в гонадном бугорке. Этот Y-хромосомный ген подвергается амплификации у многих мышей и крыс.
Таким образом, Y-хромосома, единственная в геноме млекопитающих, не работает непосредственно на реализацию фенотипа. Ее генетическая значимость связана с преемственностью между поколениями, в частности с контролем гаметогенеза, первичной детерминацией пола. Жесткий отбор действует только на немногие ее гены, остальная ДНК более пластична.
Номенклатура хромосом человека
Согласно последней номенклатуре такие морфологические признаки хромосомы, как теломера и центромера, специфические полосы, используются в качестве сравнительных знаков. В хромосоме выделяют короткое и длинное плечо, которые обозначаются буквами “р” и “q”, соответственно, а в каждом плече выделяют районы, которые пронумерованы последовательно от центромеры к теломере. В каждом районе хромосом полосы и сегменты нумерованы также последовательно в таком же направлении - от центромеры к теломере. Когда исследователям необходимо обозначить какой-либо участок при описании аномалии хромосом, то вначале пишут номер хромосомы, затем символ плеча (р или q), номер района и номер полосы (или сегмента) хромосомы. Например, запись - 6q 23 указывает на то, что это хромосома 6, длинное плечо, район 2, полоса (или сегмент) 3. В ряде случаев при особом способе окрашивания хромосом (высокоразрешающем методе) исследователи могут наблюдать и разделение сегмента на подсегменты, которые также необходимо указывать при описании кариотипа больного. Например, запись - 16q11.2 говорит о том, что аномалия затрагивает хромосому 16, длинное плечо, район 1, сегмент 1, подсегмент 2. Районы и сегменты на хромосомах проявляются после дифференциального окрашивания хромосом различными методами, которые также следует указывать при описании хромосомных аномалий.
Кроме того, в номенклатуре существует определенная символика для описания всех типов хромосомных аномалий. Так структурные аномалии типа делеций, дупликаций, инверсий, инсерций и транслокаций обозначаются как del, dup, inv, ins и t, соответственно. Ломкость и маркерные хромосомы в кариотипе обозначаютя как fra и mar, соответственно, а кольцевая хромосома - r. При рассуждении о происхождении различных аномалий хромосом, в том числе и маркерных, применяют обозначение der (derivate - происхождение). Численные аномалии обозначаются измененным числом хромосом в кариотипе и указанием (+) или (-) той или иной присутствующей или отсутствующей хромосомы (исключением являются половые хромосомы, при количественных аномалиях которых (+) или (-) никогда не ставится). Так например, синдром Дауна в цитогенетической номенклатуре записывается как 47,ХХ,+21 (девочка) и 47,ХУ,+21 (мальчик), а синдром Клайнфельтера 47,ХХУ. Причем, отсутствие одного из гомологов хромосом или его части в кариотипе, несмотря на тип аберрации (численной или структурной), носит название моносомии (полной или частичной), а присутствие - трисомии (полной или частичной). Полиплоидии отражаются только числом хромосом. При мозаицизме обозначают каждый аномальный и нормальный клон клеток, после которого записывают число метафазных пластинок с данным кариотипом. Так например, запись кариотипа 47,ХХ,+21[60]/46,ХХ[40] говорит о том, что у девочки с мозаичной формой синдрома Дауна при анализе 100 клеток обнаружено 40 клеток с нормальным женским кариотипом и 60 клеток с регулярной трисомией по хромосоме 21.