Модуль 2 Молекулярные основы наследственности

Комплексная цель:

Дать целостное представление о структуре и функциях нуклеиновых кислот; их роли в наследственности; рассмотреть основные этапы матричных процессов в эукариотической клетке; дать целостное представление о генах и геноме человека; рассмотреть вопросы организации генетического материала в ядре клетке; о строении и функциях хромосом в клеточном цикле; охарактеризовать взаимосвязь между структурой хроматина и его функциональной активностью, а также рассмотреть особенности кариотипа человека и методы его анализа.

Фильм "Матричные процессы в клетке"

Глава 4. Структура днк и матричные процессы в клетке

4.1. Строение нуклеиновых кислот. Репликация

4.2. Транскрипция

4.3. Трансляция белков

Авторы: Машкина Елена Владимировна, Григорян Нарине Аразиковна

4.1. Строение нуклеиновых кислот. Репликация

Нуклеиновые кислоты – высокомолекулярные органические соединения, обеспечивающие хранение и передачу генетической информации в живых организмах. Впервые были описаны в 1869 году Фридрихом Мишером. В природе существуют нуклеиновые кислоты двух типов – ДНК и РНК.

Среди нуклеотидов выделяют аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил – азотистые основания, они представлены на рисунке 4.1.

Рисунок 4.1. Азотистые основания

Нуклеотиды – это мономеры нуклеиновых кислот (рис. 4.2.). Нуклеиновые кислоты в эукариотических клетках находятся в ядре. Мономеры, из которых потом строятся нуклеиновые кислоты, состоят из азотистого основания, остатка сахара (дезоксирибоза или рибоза) и фосфата. Сахара вместе с азотистым основанием называются нуклеозидами (аденозин, гуанозин, тимидин, цитидин). Если к ним присоединены 1-, 2-, или 3-фосфорных остатка, то вся эта структура называется соответственно, нуклеотизид монофосфатом, дифосфатом или трифосфатом или нуклеотидом (аденин, гуанин, тимин, цитозин).

Азотистое основание, входящее в состав ДНК делится на две группы – пиримидиновую и пуриновую. В состав ДНК входит аденин, тимин, цитозин и гуанин, в РНК вместо тимина урацил. Как известно, ДНК – это большой архив, в котором хранится информация, а РНК – это молекула, которая переносит информацию из ядра в цитоплазму для синтеза белков. С различием в функциях связаны различия в строении.

НК более химически активна из-за того, что ее сахар - рибоза – имеет в своем составе гидроксильную группу, а в дезоксирибозе кислорода нет. Из-за отсутствия кислорода ДНК более инертно, что важно для ее функции хранения информации, чтобы она не вступала ни в какие реакции.

Рисунок 4.2. Строение нуклеотидов

Нуклеотиды способны взаимодействовать друг с другом, при этом "выбрасывается" два фосфора, и между соседними нуклеотидами образуется связь. В молекуле фуранозы молекулы углерода пронумерованы. С первым связано азотистое основание. Когда образуется цепочка нуклеотидов, связь осуществляется между пятым углеродом одной и третьим углеродом другой фосфорной кислоты. Поэтому в цепочке нуклеиновых кислот выделяют разные неравнозначные концы, относительно которых молекула не симметрична (рис. 4.3.).

Рисунок 4.3. Полинуклеотидная цепь ДНК

Комплементарные друг другу одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты способны образовывать двуцепочечную структуру (рис. 4.4.). Внутри этой спирали аденин образует пару с тимином, а гуанин - с цитозином.

Однако нуклеотиды способны образовывать пары как угодно. Единственная причина, по которой они соединяются так, и никак иначе, заключается в том, что угол между "хвостиками", которые идут к сахарам, совпадает только в этих парах, и, кроме того, совпадают их размеры. Никакая другая пара не образует такой конфигурации. А поскольку они совпадают, то их через сахаро-фосфатный остов можно связать друг с другом. Структуру двойной спирали открыли в 1953 году Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик.

Рисунок 4.4. Комплементарное взаимодействие между нуклеотидами

При соединении друг с другом против 5’-конца одной нити находится 3’-конец другой нити. То есть нити идут в противоположных направлениях – нити в ДНК антипараллельны. На рисунке видно, что аденин соединяется с тимином двумя водородными связями, а гуанин соединяется с цитозином тройной водородной связью. Если молекулу ДНК подогревать, то ясно, что две связи легче разорвать, чем три, это существенно для свойств ДНК.

В силу пространственного расположения сахаро-фосфатного остова и нуклеотидов, когда нуклеотиды накладывают один на другой и "сшивают" через сахаро-фосфатный остов, цепочка начинает заворачиваться, тем самым образуя знаменитую двойную спираль (рис. 4.5.). Внутри спирали имеются бороздки: маленькая и большая. Через эти бороздки с ДНК взаимодействуют белки и распознают там последовательность нуклеотидов.

При нагревании ДНК водородные связи разрываются и нити в двойной спирали расплетаются. Процесс нагревания называется плавлением ДНК, при этом разрушаются связи между парами А-Т и Г-Ц .Чем больше в ДНК пар А-Т, тем менее прочно нити друг с другом связаны, тем легче ДНК расплавить.

Рисунок 4.5. Двойная спираль ДНК

Переход из двухспиральной ДНК в одно-спиральную измеряется на спектрофотометрах по поглощению света при 260 нм. Температура плавления ДНК зависит от А-Т/Г-Ц состава и размера фрагмента молекулы.

Молекула ДНК, состоящая из двух спиралей, удваивается при делении клетки. Удвоение ДНК основано на том, что при расплетении нитей к каждой нити можно достроить комплементарную копию, таким образом, получая две нити молекулы ДНК, копирующие исходную. Репликация ДНК происходит полуконсервативным путем (рис. 4.6.).

Рисунок 4.6. Реплицирующаяся молекула ДНК

В процессе репликации участвует целый ряд ферментов с определенными функциями. Их называют ДНК- полимеразами I, II и III. Сведения о функциональных особенностях ДНК-полимераз приведены в таблице 4.1. Основная функция полимеразы III- синтез цепи, полимеразы I- синтез и исправление ошибочно вставленных нуклеотидов. Полимераза II осуществляет особые, специализированные функции.

Таблица 4.1.

ДНК- зависимые ДНК-полимеразы

Проявляемая функция (активность)	Полимераза
Pol I	Pol II	Pol III			Фрагмент Кленова
Полимеразная 5'-3'	есть	есть		есть		есть
Экзонуклеазная 3'-5'	есть	есть		есть		есть
Экзонуклеазная 5'-3'	есть	нет		нет		нет

Репликация начинается с расплетания цепей ДНК специальными расплетающими белками, которые называют геликазами (Rep-протеином). Геликазы используют энергию АТФ в процессе расплетания цепей. Скорость расплетания составляет около 6000 мин-1. Для того чтобы расплетенные цепи не могли вновь соединиться, имеются специальные SSB-белки (single-strand binding proteins), которые присоединяются к комплементарным цепям, удерживая их от ассоциации. Структура, которая образуется во время репликации, называется репликативной вилкой (рис. 4.7.).

Процесс репликации происходит с большой точностью, но не абсолютной. Бактериальная ДНК-полимераза делает ошибки, то есть вставляет не тот нуклеотид, который был в матричной молекуле ДНК, примерно с частотой 10-6

Рисунок 4.7. Строение репликативной вилки

У эукариот ферменты работают точнее, так как они более сложно устроены, уровень ошибок при репликации ДНК у человека оценивается как 10-7–10-8. Точность репликации может быть разной на разных участках генома, есть участки с повышенной частотой мутаций и есть участки более консервативные, где мутации происходят редко.

По мере продвижения репликационной вилки SSB-протеины передвигаются по цепи, диссоциируя с одного места и присоединяясь на другом. Этот процесс не требует затрат энергии АТФ. После освобождения достаточного места начинается синтез праймера - затравки, необходимой для работы ДНК-полимеразы. В качестве затравки на каждой из разделенных цепей синтезируются маленькие отрезки молекул РНК при помощи фермента примазы (рис. 4.8.).

ДНК-полимераза способна наращивать ДНК только на 3΄- конце. При синтезе новых копий на каждой нити одна новая нить удлиняется в направлении от 5΄ к 3΄ , а другая – в направлении от 3΄ к 5-концу. Однако 5΄ конец ДНК-полимераза наращивать не может. Поэтому синтез одной нити ДНК, той, которая растет в "удобном" для фермента направлении, идет непрерывно (она называется лидирующая или ведущая нить), а синтез другой нити осуществляется короткими фрагментами (они называются фрагментами Оказаки). Когда синтез на одном из фрагментов Оказаки достигает праймера другого фрагмента, РНК-овый праймер удаляется имеющейся у полимераз 5'-3' экзонуклеазной активностью и достраивается дезоксирибонуклеотидами (рис. 4.9.). После этого сахарофосфатный остов между фрагментами сшивается ковалентной связью при помощи фермента ДНК-лигазы.

Рисунок 4.8. Белки, участвующие в репликации ДНК

Рисунок 4.9. Белки, участвующие в репликации ДНК

Частота возникновения ошибок при репликации и транскрипциине превышает 10-8-10-9, то есть возможна лишь одна ошибка на сотни миллионов нуклеотидов. Такая точность не может быть обеспечена одним только лишь правилом комплементарности нуклеотидов (обеспечивающим точность 1:10000-1:100000). Репликационный аппарат имеет собственные механизмы "поддержания точности" копирования генетической информации. Этими функциями обладают все ДНК-полимеразы. Модель структуры и функциональных участков (на примере ДНК-полимеразы I) показана на рисунке 4.9. Она имеет три зоны активности - полимеризующую в направлении 5'-3', и экозонуклеазные в направлениях 5'-3' и 3'-5'. Области активности разделены пространственно. Вперед (по ходу продвижения полимеразы по матричной цепи ДНК) обращена зона 5'-3' экзонуклеазной активности. Она служит для удаления попадающихся на пути РНК-овых праймеров. Далее идет собственно синтетическая зона и наконец, зона с экзонуклеазной активностью в направлении 3'-5'. С этой зоной связана способность узнавать неправильно встроенные нуклеотиды и исправлять их вырезанием ряда уже встроенных нуклеотидов. Для этого молекула ДНК-полимеразы смещается (не отсоединяясь от ДНК-овой матрицы) к месту синтеза и последовательно вырезает нуклеотиды, после чего возобновляется нормальный синтез.

Молекулы РНК очень часто претерпевают посттранскрипционную модификацию, заключающуюся в удалении участков построенной цепи. Процессинг ( созревание ) мРНК . Синтезированная молекула мРНК (первичный транскрипт) подвергается дополнительным превращениям. В большинстве случаев исходная молекула мРНК разрезается на отдельные фрагменты. Одни фрагменты – интроны – расщепляются до нуклеотидов, а другие – экзоны – сшиваются в зрелую мРНК. Процесс соединения экзонов называется сплайсингом. Наглядно это можно проследить на примере синтеза молекулы транспортной РНК (рис. 4.10).

Сплайсинг характерен для эукариот и архебактерий, но иногда встречается и у прокариот. Существует несколько видов сплайсинга. Сущность альтернативного сплайсинга заключается в том, что одни и те же участки исходной мРНК могут быть и интронами, и экзонами. Тогда одному и тому же участку ДНК соответствует несколько типов зрелой мРНК и, соответственно, несколько разных форм одного и того же белка. Установлено, что некоторые генетические заболевания человека (фенилкетонурия, некоторые гемоглобинопатии) обусловлены нарушением сплайсинга.

Сущность транс–сплайсинга заключается в соединение экзонов, кодируемых разными генами (иногда даже из разных хромосом), в одну зрелую молекулу мРНК.

Регуляция на уровне процессинга РНК обеспечивает возможность образования различных типов зрелой, функционально активной мРНК. Процессинг РНК регулируется с помощью рибозимов (катализаторов рибонуклеиновой природы) и ферментов матураз .