22.3 Механизм генной терапии
В соответствии с основной догмой молекулярной биологии генетическая информация передается в направлении ДНК →РНК →белок (сплошные черные линии). Позднее у РНК-содержащих вирусов были обнаружены другие пути передачи генетической информации (красные линии): у других – репликации/транскрипции РНК →РНК.
В принципе возможно, хотя и не обнаружено, считывание белка с матрицы ДНК (пунктирная черная линия). Запрещено только направление передачи генетической информации от белка к нуклеиновым кислотам.
Рис. 22.1. Пути передачи генетической информации.
Классификация генной терапии
по типу клеток-мишеней:
соматическая
фетальная
по цели воздействия:
позитивная (компенсация экспрессии гена)
негативная (подавление функций гена)
по тактике введения генотерапевтического агента:
ex vivo (клетки крови)
in situ (локально)
in vivo (системное введение)
in utero (введение конструкций в эмбрион)
по типу векторной системы:
вирусные векторы
невирусные векторы
микроинъекция
"gene gun" (генный пистолет)
по применяемым агентам:
нуклеиновые кислоты
белки
иммунотерапия
22.3.1 Генотерапевтические агенты.
Нуклеиновые кислоты – генотерапевтические агенты:
Антисенс ДНК и РНК
Рибозимы
Peptide – nucleic acids (PNA)
РНК – ловушки
Рис. 22.2. Антисенс ДНК и РНК
Преимущества:
относительная специфичность дуплекса
возможность экспрессии в составе любого вектора
отсутствие иммуногенности
Недостатки:
быстрая деградация (РНКазы, ДНКазы) в клетке
Рис. 22.3. Рибозимы
Сайт расщепления NUY N – любой нуклеотид Y – любой, кроме G Типы:
Головка молотка
Шпилька
Интроны группы I, II
Преимущества:
каталитические свойства (расщепление мишени)
в процессе взаимодействия с мишенью молекулы не расходуются (ингибирование экспрессии гена – мишени при низких концентрациях)
отсутствие иммуногенности
индукция интерферона
Недостатки:
быстрая деградация (РНКазы, ДНКазы) в клетке
Возможно создание модифицированных рибозимов
Рис . 22.4 . Peptide – nucleic acids (PNA)
Дуплексы DNA/PNA более стабильны, чем дуплексы DNA/RNA.
Дуплексы DNA/PNA не подвержены действию RNase H, протеаз, пептидаз.
РНК - ловушки
Гиперэкспрессия коротких РНК (РНК – ловушки), направленных на cis– активаторные регуляторные элементы, могут использоваться как ловушки для trans– активаторных белков.
Механизм действия - блокирование связывания трансактиваторных белков вируса с регуляторными элементами
Белки – генотерапевтические агенты.
Трансдоминантные негативные белки
Одноцепочечные антитела (intrabodies)
Суицидные гены
Трансдоминантные негативные белки – мутантная версия регуляторных или структурных белков. Механизм действия состоит в :
конкуренции за субстраты и кофакторы;
образование нефункциональных мультимерных комплексов
Преимущества:
возможность использования в составе невирусных векторов
Недостатки:
иммуногенность;
использование в качестве ТНБ клеточных (невирусных) белков
Рис. 22.5. Трансдоминантные негативные белки – механизм действия
Одноцепочечные антитела
Новый класс генотерапевтических агентов (рис. 22.6). Одноцепочечные вариабельные фрагменты антител с сохраненными свойствами антиген-специфичности, получаемые клонированием и экспрессией генов легких и тяжелых цепей антител.
Рис. 22.6. Одноцепочечные антитела.
А) Вариабельные домены тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей (около 110 а.а.)
B ) Домены соединены гибким линкером (глицин(4)-серин(3))
C ) Использование домена Ck легкой цепи разрешает димеризацию – увеличение активности и стабильности
Преимущества:
возможность экспрессии в гетерологичных системах
сохранение всех свойств классических антител
Недостатки: отсутствие возможности к секреции (связаны с эндоплазматической сетью).
(Использование сигнальных последовательностей позволяет одноцепочечным антителам секретироваться).
Суицидные гены
Рис. 22.7. Суицидные гены.
Вместо ингибирования (или компенсации) функции дефектного гена возможно использование суицидных генов (рис. 22.7), экспрессия которых вызывает гибель клетки-мишени. Примерами являются А-цепь дифтерийного токсина, ген цитозиндеаминазы, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV tk).