3. Обнаружение возбудителей ботулизма в кормах. Микотоксикозы.

Исследования на анаэробы (в т. ч. ботулизм).

50 г корма растирают в стерильной ступке с физиологическим раствора и засевают в несколько пробирок со средой Китта-Тароцци, молоком и по 2 чашки со средами Вильсона - Блера и кровяным агаром по Цейслеру. Для уничтоження вегетативных форм по одной пробирке с жидкими средами прогревают при температуре 80° С в течение 20 минут. Посевы помещают в термостат при температуре 37 С. Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной поглотитель кислорода.

Результаты посевов регистрируют в первый же день. Почернение среды Кильсона - Клера в течение 1-3 часов после посева, свертывание молока с образованием ноздревато-губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6 часов, а также быстрое начало роста на среде Китта - Тароцци (через 4-5 часов) при обильном газообразовании является характерным для клостридиум перфрингенс.

Рост клостридиум ботулинум (возбудитель ботулизма), наблюдаемый обычно на 2-З-й день, характеризуется помутнением среды Китта - Тароцци, образованием осадка и запахом прогорк-того масла.

При обнаружении роста на среде Китта - Тароцци производят микроскопическое исследование и выделение чистой культуры посевом на 2-3 чашки с кровяным агаром по Цейслеру, которые выдерживают в анаэробных условиях при температуре 37° С в течение 24-48 часов, после чего просматривают рост в чашках и отбирают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам.

Биологическую пробу (заражение) проводят на морских свинках или белых мышах путем внутрибрюшинного заражения бульонной культурой. При положительном результате подопытные животные гибнут через 12-48 часов.

При исследовании кормов на ботулизм (наличие токсинов) в качестве подопытных животных используют белых мышей. При этом могут быть применены два способа:

а) нейтрализация токсина противоботулиновой сывороткой (антитоксином). Корм предварительно растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором (1:4) и настаивают в течение 1-2 часов при комнатной температуре. Настой центрифугируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К 0,5 мл фильтрата добавляют 0,2 мл поливалентной противоботулиновой сыворотки. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, затем одному животному вводят подкожно 0,5 мл фильтрата, другому - смесь фильтрата с сывороткой в той же дозе.

б) разрушение токсина кипячением фильтрата. Фильтрат готовят, как указано выше. Одну половину фильтрата кипятят в течение 30 минут. Затем одному животному внутрибрюшинно вводят 0,5-1,0 мл некипяченого фильтрата, другому - в этой же дозе прокипяченного.

Положительным результатом биологической пробы по первому и второму способам считают гибель мышей, наступившую как от фильтрата, не обработанного противоботулиновой сывороткой, так и от фильтрата, не подвергнутого кипячению.

Микологическое исследование кормов (исследование на присутствие микроскопических грибов).

Микроскопия смыва. Зерно или мелко нарезанный грубый корм (солому, сено и т. п.) помещают в колбу с водой и взбалтывают в течение 20-30 мин. Полученную взвесь микроскопируют. Ее можно высевать на поверхность питательных сред для выделения грибов. Этим методом устанавливают наличие токсинообразующих спороносящих грибов и в основном определяют степень поражения зерна, продуктов или корма.

Метод накопления. Метод используют для выделения грибов из зерна, грубых кормов, силоса, мучнистых кормов. Исследуемый образец выращивают в чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге. Обычно на 2-3 слоя фильтровальной бумаги в чашки Петри (диаметром 12 см) наливают 5 мл стерильной воды. При подсыхании бумаги воду подливают.

Выделение грибов из зерна. Заражение зерна грибами может быть поверхностным (заспорение), когда споры гриба присутствуют исключительно на поверхности оболочки, и глубинным (поражение), когда гриб проникает через оболочку и развивается во внутренних частях зерна. Перед посевом зерно дезинфицируют. Для дезинфекции используют 3%-ный раствор формалина (за исходный берется 38-40%-ный раствор формальдегида) или другие препараты. Зерно (не менее 50 штук), завернутое в марлевую салфетку, помещают в стаканчик или бюкс с дезинфектантом; через 2-3 мин его промывают в другом сосуде со стерильной водой, в которую для нейтрализации формалина добавляют 2-3 капли аммиака. Воду сливают, слегка раздвигают марлю и стерильным пинцетом раскладывают зерна равномерно в чашки Петри на фильтровальную бумагу таким образом, чтобы они не соприкасались друг с другом. Чашки Петри помещают в термостат при 24-25° с, периодически просматривают в течение 10, иногда 15 дней. При сильной степени поражения образцов обычно на 2-3-й день наблюдается обильный рост мицелия токсинообразующих грибов. Под бинокулярным микросокпом (увеличение в 25) мицелий или споры гриба осторожно переносят микологическим крючком в пробирку с сусловым агаром. В дальнейшем изучают выделенный гриб в чистой культуре. Степень поражения зерна определяют в процентах по отношению количества поврежденных грибами зерен к их общему количеству в чашке (обычно не менее 200-400), а грубых кормов — по условной оценке (сильно пораженные, средне, слабо и т.д.).

Выделение грибов из силоса, жмыха и мучнистых кормов. Нарезанный силос раскладывают (по 10 кусочков) на поверхности агаризованнон среды в чашки Петри. Так же сеют и жмыхи, предварительно измельчив их. Для выделения грибов из мучнистых кормов (муки, отрубей, комбикорма, шрота, мясокостной и рыбной муки) пользуются методом непосредственного посева и методом разведения. 10 г мучнистого корма помещают в стерильную колбу, куда добавляют 90 мл стерильной воды и получают основное разведение (1 : 10). Колбу с содержимым взбалтывают в шуттель-аппарате или вручную в течение 15-20 мин. Из основного разведения готовят разведения 1 : 100, 1 : 1000, 1 : 10 000 и т. д. на стерильной воде. Степень разбавления основной взвеси зависит от содержания в корме спор грибов. Комбикорм сеют обычно в разведении 1 : 1000 в 5 чашек Петри, при большей степени поражения грибами — в разведении 1 : 10 000 в 8-10 чашек. Разведения готовят с помощью стерильных пипеток; для каждого разведения рекомендуется брать отдельную пипетку. По 1 мл готового разведения вносят в чашки петри. При этом материал распределяют каплями на дне чашки; в чашки заливают по 10 мл расплавленной агаризованной остуженной до 40-45° с среды. Круговыми движениями чашек материал равномерно распределяют в агаре. Посевы всех видов кормов культивируют при температуре 22-25° с. Чашки просматривают на 3-, 5-, 9-й день после посева. Рекомендуется посевы выдерживать дополнительно 2-3 дня для выявления медленно развивающихся форм.

Терминология (микологические термины):

Спорангий – это орган, производящий споры у грибов.

Мицелий (грибница) – это вегетативное тело грибов, состоящее из гифов (тонких разветвленных нитей).

Септированный – с наличием межклеточных перегородок (мицелий представляет 1 большую клетку с большим кол-вом ядер).

Несептированный – без межклеточных перегородок (мицелий разделен на клетки, которые содержат 1 или несколько ядер).

Конидии – это неподвижные споры бесполого размножения у грибов (от обычных спор они отличаются тем, что образуются не в спорангиях, а открыто – на выростах мицелия (конидиеносцах)).

Конидиеносцы – это выросты мицелия, в которых образуются конидии.

Макроконидии – это толстостенные многоклеточные споры бесполого размножения.

Микроконидии – это одноклеточные споры бесполого размножения.

Характеристика некоторых грибов:

Mucor – колонии серовато-белые, пушистые; мицелий несептированный, спорангии шаровидные.

Rhizopus – колонии черные, точечные; мицелий несептированный; спорангии шаровидные.

Aspergillus – колонии белые, желтовато-зеленые, серо-голубые или черные; на конце конидиеносца – булавовидное расширение; конидии круглые, эллипсовидные.

Fusarium – колонии ватообразные, макроконидии веретеновидно-изогнутые; микроконидии – круглые или овальные.

Penicillium – колонии зеленого цвета; конидиеносцы разветвленные, конидии в виде кисточки.

Stachybotrius – колонии бурые бархатистые; спороносные гифы разветвленные, конидиеносцы длинные, конидии овальные.