Занятие №3. Тема: бактериоскопический метод исследования. Микроскопия окрашенных и неокрашенных микроорганизмов.

1. Микробные культуры и их виды.

2. Исследование микробов на подвижность.

3. Техника приготовления мазков.

4. Простые методы окраски микроорганизмов.

5. Сложные методы окраски микроорганизмов.

1. Микробные культуры и их виды.

Микробная культура – это совокупность микробных клеток на питательной среде.

Микробные культуры также бывают: агаровые (плотные) и бульонные (жидкие).

Бульонные (жидкие) микробные культуры – это совокупность микроорганизмов на жидкой питательной среде.

Агаровые (плотные) микробные культуры – это совокупность микроорганизмов на плотной питательной среде.

Микробные культуры бывают: чистыми и смешанными.

Смешанная микробная культура – это культура, содержащая в себе 2 и более видов микроорганизмов на одной питательной среде.

Чистая микробная культура – это культура, содержащая в себе 1 вид микроорганизма на одной питательной среде. Их получают из одной микробной клетки.

На поверхности плотной питательной среды микробы (бактерии и микроскопические грибы) формируют колонии.

Колония – это видимое невооруженным глазом, изолированное скопление бактерий на твердой питательной среде.

2. Исследование микробов на подвижность.

1. Приготовление препарата «раздавленная капля»

Техника приготовления:

1. На предметное стекло наносят каплю микробной культуры (при обильном росте микробов культуру разводят физ.раствором).

2. Каплю накрываю покровным стеклом (покровное стекло ставят у края капли и, опуская, постепенно вытесняют воздух).

3. Препарат микроскопируют.

Микрокартина: бактерии – бесцветные, в виде светлых или серых теней.

2. Приготовление препарата «висячая капля»

Техника приготовления:

1. На покровное стекло наносят каплю микробной культуры.

2. Края лунки часового предметного стекла смазывают вазелином.

3. Предметным стеклом накрывают покровное стекло с каплей исследуемой культуры.

4. Препарат переворачивают покровным стеклом вверх (на 180 градусов) и капля «висит» над лункой.

5. Препарат микроскопируют.

Микрокартина: бактерии – бесцветные, в виде светлых или серых теней.

3. Техника приготовления мазков.

Мазок – это нанесенный на предметное стекло исследуемый материал, предназначенный для микроскопии.

1. Техника приготовления мазков-препаратов

Мазки-препараты готовят из исследуемых микробных культур.

Этапы приготовления мазка-препарата:

1-й ЭТАП: НАНЕСЕНИЕ МАЗКА (нанесение бак. массы на предметное стекло).

1) Фломбируют (обжигают) предметное стекло над пламенем спиртовки (с той стороны, где будет нанесен мазок).

2) Кладут предметное стекло на мостик.

3) Бак. петлю фламбируют над пламенем спиртовки докрасна (сначала горизонтально, потом вертикально).

4) Открывают пробирку (чашку Петри) с культурой.

5) Края пробирки обжигают над пламенем спиртовки.

6) Вводят в пробирку бак. петлю и берут некоторое количество исследуемого материала.

7) Закрывают пробирку (чашку Петри), ставят ее в штатив.

8) Если мазок готовят из жидких микробных культур, то маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бак. петлей на середину предметного стекла и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету. Если мазок готовят из плотных микробных культур, то на середину предметного стекла наносят каплю дистиллированной воды (физ. раствора), соскабливают бак. петлей небольшое кол-во бак. массы с поверхности агара, вносят ее в каплю воды так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой

9) Бак. петлю фламбируют над пламенем спиртовки докрасна.

2-й ЭТАП: ВЫСУШИВАНИЕ МАЗКА.

Мазок высушивают при комнатной температуре. Можно мазок подсушивать, держа его высоко над пламенем горелки.

3-й ЭТАП: ФИКСАЦИЯ МАЗКА.

Фиксированными считают клетки микроорганизмов, в которых прерваны жизненные процессы, но полностью сохранена тонкая структура.

Цели фиксации:

- умертвить микробов и сделать их безопасными (особенно важно при работе с патогенными микробами),

- закрепить (зафиксировать) их на предметном стекле (чтобы они не смылись при окрашивании),

- лучшее окрашивание микробов (мертвый белок лучше воспринимает красители).

Методы фиксации:

1) Термический метод: мазок 2-4 раза проносят над верхней частью пламени горелки (всё это за 2 сек). Проверка: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти или к тыльной поверхности стороны ладони. Правильный мазок вызывает чувство СРЕДНЕГО ЖЖЕНИЯ.

2) Химический метод: мазки фиксируют в химических растворах. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.

В этиловом спирте 96°: 10-15 мин.

В ацетоне: 10 мин.

В этаноле 96°: 15-20 мин.

В жидкости Никифорова (спирт и эфире в равном соотношении (1:1)): 10-15 мин.

В перекиси водорода 3% в спирте 96% (для фиксации споровых микроорганизмов): 30 мин.

Неправильно зафиксированные мазки:

- перефиксированные: происходит коагуляция белковых структур, нарушается форма бактериальной клетки.

- недофиксированные: микробы смоются с поверхности мазка при его промывании.

4-й ЭТАП: ОКРАСКА МАЗКА.