Практическое занятие №7

1.Тема и ее актуальность: Способы преимплантационной диагностики наследственной патологии человека

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) — диагностика генетических заболеваний у эмбриона человека перед имплантацией в слизистую оболочку матки, на стадии дробления (4-10 бластомеров).

2.Учебные цели:

сформировать понятие о преимплантационной генетической диагностике;

изучить технологию ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение;

ознакомиться с технологией ИКСИ - интрацитоплазматической инъекцией сперматозоидов;

отметить различие преимплантационной генетической диагностики и пренатальной диагностики.

Для формирования профессиональных компетенций студент должен знать:

• генные мутации;

• хромосомные абберации;

• методы ПЦР-диагностики;

• геномные мутации;

• флуоресцентной гибридизации in situ;

• вспомогательные репродуктивные технологии;

• экстракорпоральное оплодотворение;

• интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоидов.

Для формирования профессиональных компетенций студент должен уметь:

• различать половые клетки человека;

• находить сходство и различие между типами дробления у позвоночных животных;

• различать способы оплодотворения: инсеминацию in vitro и интрацитоплазматической инъекцией сперматозоидов (ИКСИ).

Для формирования профессиональных компетенций студент должен владеть общекультурными (ОК – 1) и профессиональными компетенциями (ПК – 2, ПК – 3, ПК – 5, ПК – 15, ПК – 17, ПК – 31, ПК – 32).

2. Материалы для самоподготовки к освоению данной темы:

Вопросы для самоподготовки:

1. митоз и мейоз.

2. овогенез и сперматогенез.

3. строение яйцеклеток и сперматозоидов.

4. способы оплодотворения.

5. эмбриогенез у человека.

6. типы дробления позвоночных животных.

7. мутации: генные, хромосомные, геномные.

8. молекулярно-генетические методы.

9. цитогенетический метод.

4. Вид занятия: практическое.

5. Продолжительность занятия – 2 часа(90 минут).

6. Оснащение:

6.1. Дидактический материал: наборы контролирующих тестов; таблицы «овогенез», «сперматогенез», «строение яйцеклеток и сперматозоидов», «оплодотворение»; «синкарион».

6.2. Оборудование: микроскопы, микропрепараты: «яичник млекопитающего», «сперматозоиды».

7. Содержание занятия:

7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений.

Выполнение тестовых заданий.

Выберите один правильный ответ.

1. На какой стадии эмбриогенеза проводиться преимплантационная генетическая диагностика:

а) дробления

б) гаструляции

в) нейруляции

г) гисто- органогенеза

2. Что называют технологией ИКСИ:

а) экстракорпоральное оплодотворение

б) инсеминацию сперматозоидов in vitro

в) интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоидов

г) преимплантационную диагностику наследственных болезней

3. Показания к ИКСИ:

а) хромосомные мутации у обоих родителей

б) геномные мутации у матери

в) генные мутации у отца

г) плохое качество спермы

4. Преимплантационная генетическая диагностика проводится:

а) на стадии 4-10 бластомеров

б) во время гаструляции

в) на стадии 24 бластомеров

г) во время нейруляции

5. Каким гормоном проводят процедуру «стимуляции суперовуляции»:

а) тироксином

б) фолликулостимулирующим гормоном

в) инсулином

г) адренокортикотропным гормоном

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) — диагностика генетических заболеваний у эмбриона человека перед имплантацией в слизистую оболочку матки, на стадии дробления (4-10 бластомеров). При материнском носительстве генетической патологии проводится биопсия одного бластомера у эмбриона или 1-го полярного тельца до оплодотворения. ПГД является дополнительной процедурой к вспомогательным репродуктивным технологиям.

Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) — собирательное название медицинских технологий, направленных на достижение беременности пациенткой, при которых отдельные или все этапы зачатия осуществляются вне организма будущей матери. Применяются при бесплодии.

Перечень технологий, относимых к ВРТ включают:

• экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО́) и перенос эмбрионов в полость матки,

• инъекцию сперматозоида в цитоплазму ооцита,

• донорство спермы,

• донорство ооцитов,

• суррогатное материнство,

• преимплантационную диагностику наследственных болезней,

• искусственную инсеминацию спермой мужа (донора)".

Во время ЭКО яйцеклетку извлекают из организма женщины и оплодотворяют искусственно в условиях «in vitro» («в пробирке»), полученный эмбрион содержат в условиях инкубатора, где он развивается в течение 2—5 дней, после чего эмбрион переносят в полость матки для дальнейшего развития.

Технологию ЭКО осуществляют в специализированных медицинских учреждениях. Для проведения процедуры экстракорпорального оплодотворения необходимо получить яйцеклетки, получить сперматозоиды, провести оплодотворение in vitro, вырастить эмбрион, ввести эмбрион в полость матки женщины.

Как правило, для экстракорпорального оплодотворения стараются получить несколько яйцеклеток, так как это повышает эффективность лечения бесплодия этим методом. Поскольку в норме у женщины в течение одного менструального цикла созревает одна яйцеклетка, то для получения нескольких яйцеклеток проводят так называемую процедуру «стимуляции суперовуляции». Для этого пациентке назначают инъекции гормональных препаратов. Для стимуляции используют инъекции препаратов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), хорионического гонадотропина (ХГ), а также блокаторов гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ). При достижении фолликулом определенного размера (16-20 мм) назначают процедуру извлечения яйцеклеток — пункцию фолликулов яичника. Пункцию фолликулов проводят под анестезией, ход иглы контролируют аппаратом УЗИ.

Обнаруженные яйцеклетки отмывают от фолликулярной жидкости и переносят в лабораторную посуду с культуральной средой. В качестве лабораторной посуды используют чашки Петри, либо культуральные планшеты. Посуду с яйцеклетками помещают в инкубаторы, где они содержатся до оплодотворения.

Сперму пациент получает самостоятельно. Сперму получают в день пункции фолликулов супруги. Перед оплодотворением яйцеклетки сперматозоиды отделяют от семенной жидкости. Для этого проводят многократное центрифугирование спермы в культуральной среде.

Непосредственно ЭКО проводится врачами-эмбриологами в условиях эмбриологической лаборатории. Собственно оплодотворение проводят одним из двух способов: 1) инсеминация in vitro; 2) интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (ICSI, ИКСИ). При первом, более простом способе к яйцеклеткам, которые находятся в питательной среде, добавляют суспензию сперматозоидов. Сперматозоиды добавляют из расчета 100-200 тыс. на одну яйцеклетку. В течение 2-3 часов один из сперматозоидов проникает в яйцеклетку и тем самым оплодотворяет её. При втором способе (ИКСИ) сперматозоид вводят в яйцеклетку «вручную» с помощью микрохирургических инструментов. ИКСИ используют при очень плохом качестве спермы, когда оплодотворение не может быть получено даже в чашке.

После проникновения сперматозоида яйцеклетка считается эмбрионом. Вероятность успешного оплодотворения 60-70%. Эмбрионы содержат в искусственных условиях от 2 до 6 дней. Для этого используют так называемые СО₂-инкубаторы — шкафы, в которых поддерживается температура 37 C и содержание СО₂ в атмосфере 5-6%. Эмбрионы в инкубаторах непосредственно содержат в пластиковых чашках (чашки Петри) с культуральной средой. В культуральную среду для эмбрионов входят основные физиологические ионы (Na⁺, K⁺, Ca₂⁺, Mg₂⁺, Cl^-, CO₃^2- и т.д.), энергетические субстраты (глюкоза, пируват, лактат), аминокислоты, часто витамины и белки сыворотки крови. За время инкубации эмбрион человека практически не увеличивается в размере (первые 4 дня его размер 0,1 мм, на 5 день 0,15-0,2 мм), но количество клеток, его составляющих, возрастает многократно (1 день — 1 клетка; 2 день — 4 клетки; 3 день — 8 клеток; 4 день — от 10 до 20 клеток, 5 день — от 40 до 200 клеток).

Перенос эмбриона в матку осуществляют через 2—5 дней после оплодотворения яйцеклетки.

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) — исследование наличия некоторых хромосомных или некоторых генетических патологий у эмбриона до имплантации. Также этим методом возможно определить пол эмбриона. Для определения хромосомных аномалий используют методы ПЦР-диагностики, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Метод ПЦР остался незаменимым для диагностики моногенных заболеваний.

Преимплантационная генетическая диагностика показана супружеским парам, у которых имеется носительство хромосомной перестройки или моногенного заболевания. Примерами моногенных заболеваний могут служить муковисцидоз, болезнь Тея — Сакса, серповидноклеточная анемия, гемофилия А, миодистрофия Дюшена и многие другие.

Кроме этого, преимплантационная генетическая диагностика проводится у супружеских пар с повышенным риском врождённых аномалий у детей, который не связан с носительством диагностированных мутаций. К таким случаям относятся пары, где возраст матери превышает 35 лет; где возраст отца выше 39 лет; если у отца наблюдаются тяжёлые нарушения сперматогенеза; у супружеских пар с привычным невынашиванием; у супружеских пар с повторяющимися неудачными попытками ЭКО.

В случае неопределённого повышенного риска рождения ребёнка с врожденными аномалиями преимплантационная генетическая диагностика проводится для девяти хромосом, с которыми связаны наиболее часто встречающиеся врождённые заболевания. Это хромосома 13 (синдром Патау), хромосома 15 (синдром Прадера-Вилли), хромосома 16, хромосома 17, хромосома 18 (синдром Эдвардса), хромосома 21 (синдром Дауна), хромосома 22 (синдром «кошачьих зрачков»), а также половые хромосомы X и Y (различные численные аномалии, включая синдром Шерешевского — Тернера и синдром Кляйнфельтера).

Преимплантационную генетическую диагностику проводят в некоторых случаях, не связанных с возможной генетической патологией плода, целью такой диагностики является рождение ребёнка с определёнными генетическими характеристиками. К таким случаям относится, например, преимплантационная генетическая диагностика, проводимая для предотвращения резус-конфликта.

Существует случаи, когда комбинируются несколько предпосылок к преимплантационной генетической диагностике. Одним из таких примеров является случай, когда при помощи преимплантационной генетической диагностики был рождён HLA-совместимый донор для клеточной терапии анемии Фанкони у пробанда. В данном случае была исключена анемия Фанкони и был подобран нужный тип гистосовместимости.

Если генетическое нарушение наследуется от женщины, то можно отобрать «здоровые» эмбрионы, пройдя процедуру тестирования только полярных телец, не трогая сам эмбрион. Также можно протестировать только бластомеры. Либо может проводиться последовательное изучение полярных телец, затем бластомеров.

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) — метод цитогенетического анализа, используемый для выявления и локализации специфических последовательностей ДНК на метафазных хромосомах и в интерфазных ядрах. В этом методе используются ДНК-зонды, которые представляют собой нуклеотидную последовательность ограниченного размера, комплементарную определённому участку ядерной ДНК. Зонд несет «метку», то есть содержит нуклеотиды, связанные с флуорофором (молекулу, способную к флуоресценции). После процедуры гибридизации в случае образования гибридной молекулы ДНК-зонда и ДНК мишени на исследуемом цитогенетическом препарате можно наблюдать свечение специфических последовательностей ДНК на хромосомах или в ядрах при помощи флуоресцентного микроскопа.

Возможность диагностики ещё до наступления беременности является главным преимуществом ПГД. Такая диагностика минимизирует риск того, что придется прервать развитие плода по генетическим причинам. Кроме того, в цикле ЭКО-ПГД получают обычно несколько эмбрионов, что позволяет выбрать эмбрион без генетического нарушения. Недостатками ПГД являются необходимость прохождения лечебного цикла ЭКО, достаточно высокая стоимость. Тем не менее, преимущества ПГД и опыт применения в разных клиниках во всем мире доказывают эффективность этой технологии. На сегодняшний день ПГД предоставляет пациентам с наследственной патологией альтернативный способ снизить риск беременности больным плодом и рождения ребёнка с генетическим заболеванием. Необходимо учитывать, что ПГД не может являться полной заменой пренатальной диагностики. В связи с тяжестью наследственной патологии, которая проверяется при ПГД и пренатальной диагностике, необходимо применить все методы исследования и подтверждающей диагностики, чтобы исключить генетический дефект.

7. 3. Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме.

Преподаватель знакомит студентов с планом и методикой проведения практической работы.

Практическая работа 1

Сперматозоиды млекопитающего

Рассмотрите при малом, а затем большом увеличении микроскопа сперматозоид млекопитающего (быка).

Практическая работа 2

Яйцеклетка крольчихи

Изучите при малом и большом увеличении микроскопа яйцеклетку млекопитающего (срез яичника крольчихи). В демонстрационном препарате обратите внимание на зоны развития половых клеток в срезе яичника.

Решить ситуационные задачи

І. Мужчина и его сын больны гемофилией. Жена мужчины беременна. Опасаясь, что у нее родится сын – гемофилик, она обратилась в медико-генетическую консультацию с просьбой определить пол плода и прервать беременность, если выяснится, что плод мужского пола. Врачи, побеседовав с нею, рекомендовали ей сразу прервать беременность, не проводя амниоцентеза. Верна ли эта рекомендация?

ІІ. По данным анамнеза мать здорова и происходит из благополучной по одной из форм ихтиоза семьи (Х сцепленный рецессивый тип наследования), а отец – болен этой формой ихтиоза. Дочь этих родителей выходит замуж за здорового юношу. Определите степень генетического риска рождения больного данной формой ихтиоза ребенка в этой молодой семье. Какие методы пренатальной диагностики могут быть использованы для обнаружения данного заболевания у плода? Какие рекомендации должен дать врач-генетик?