3. Материалы для самоподготовки к освоению данной темы:

1. Принципы получения образцов геномной ДНК или РНК.

2. Общий принцип классической ПЦР. Оборудование, применяемое для амплификации.

3. Состав PCR реакции. Параметры PCR реакции.

4. Общий принцип real-time PCR.

5. Рестрикция ДНК на фрагменты. Рестриктазы, принцип их работы.

6. Сущность метода электрофореза фрагментов ДНК.

7. Сущность метода блот-гибридизации по Саузерну.

8. Классификация методов ДНК диагностики: прямые и косвенные.

9. Принципы прямой ДНК-диагностики. Преимущества и недостатки.

10. Прямые методы ДНК-диагностики: рестрикционный анализ, аллельспецифичная ПЦР, real-time PCR, обратно-транскриптазная ПЦР (RT-PCR), секвенирование по Сэнгеру, SSCP-анализ, ДНК-биочипы.

11. Принципы косвенной ДНК-диагностики. Преимущества и недостатки.

12. Косвенные методы ДНК-диагностики: анализ сцепления, использование мини- и микросателлитов (VNTR, STR).

4. Вид занятия: практическое занятие

5. Продолжительность занятия: 2 часа (90 мин).

6. Оснащение.

6.1. Дидактический материал: наборы контролирующих тестов; таблицы генетического кода

6.2. Оборудование: ноутбук, проектор, набор слайдов по теме.

7. Содержание занятия:

7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений.

Тестирование студентов.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия

7.3. Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме

Преподаватель знакомит студентов с планом и методикой проведения практической работы.

7.4. Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя

Практическая работа Работа № 1 Разработка аллель-специфического днк-зонда.

Пациент с генетической болезнью имеет мутацию (замену цитозина на тимин) в 18 экзоне гена.

Нормальная последовательность:

ctg tgc cgt atg aaa aga cca atc cga gaa gtt cct gtt acc aaa ctc ata gac

Последовательность у пациента:

ctg tgc cgt atg aaa aga cca atc tga gaa gtt cct gtt acc aaa ctc ata gac

1. Каково воздействие этой мутации на функции гена и белка? (Первые три нуклеотида в каждой последовательности представляют первый кодон экзона).

2. Вам необходимо разработать аллель специфичный олигонуклеотидный (АСО) зонд для поиска мутации в геномной ДНК. Какой из приведенных ниже олигонуклеотидов окажется полезным для АСО-зонда на нормальную последовательность? Для мутантной последовательности? Дайте обоснование вашего выбора для каждого олигонуклеотида.

1. 5 gcc gta tga aaa gac caa tct c 3

2. 5 gac caa tcc gag aag ttc c 3

3. 5 gac caa tct gag aag ttc c 3

4. 5 gga act tct cag att ggt c 3

5. 5 atc tga g 3

Работа № 2 Моделирование пцр-анализа делеции f508 гена cftr при диагностике муковисцидоза

1. Конструирование праймеров размером 10 нуклеотидов для правого и левого участков интересующего фрагмента ДНК размером 30 пн:

смысловая цепь ДНК - 5’ act gcg agc tta cgg ttt cat ggg cga gat 3’

антисмысловая цепь ДНК - 3’ tga cgc tcg aat gcc aaa gta ccc gct cta 5’

Праймеры:

Прямой

5’ act gcg agc t 3’

антисмысл. ДНК - 3’ tga cgc tcg aat gcc aaa gta ccc gct cta 5’

Обратный

смысловая ДНК - 5’ act gcg agc tta cgg ttt cat ggg cga gat 3’

3’a ccc gct cta 5’

2. Проведение ПЦР и интерпретация результатов.

1) В норме у здорового человека размер искомого фрагмента ДНК равен 30 пн. Это нормальный аллель, обозначаемый как А.

2) При делеции 3-х пар нуклеотидов в 13-м, 14-м и 15-м положениях смысловой цепи ДНК триплет cgg) будет амплифицироваться фрагмент размером 27 пн. Это мутантный аллель, обозначаемый как а.

3) Идентификация результатов амплификации путем разделения фрагментов ДНК на электрофорезе (см. рис. 1):

Объясните полученные результаты. Проверьте свой ответ

Рис 5.1. Электрофореграмма и интерпретация результатов амплификации образцов ДНК индивидов с генотипами АА, Аа, аа.

Проверьте свой ответ.

Интерпретация полученных результатов:

Генотип «АА» – норма – поскольку оба аллеля имеют одинаковый размер, на электрофореграмме будет выявляться одна полоса размером 30 пн – аллели А (см. рис. 1).

Генотип «Аа» – гетерозиготный носитель - на электрофореграмме будут выявляться две полосы, соответствующие размерам фрагментов 27 и 30 п.н. (аллели А и а).

Генотип « аа» – гомозигота по мутантным аллелям - поскольку оба фрагмента ДНК имеют одинаковый размер, на электрофореграмме будет выявляться одна полоса размером 27 п.н.

7.5. Контроль конечного уровня усвоения темы:

Выполнение тестовых заданий и решение ситуационных задач.