Лабораторная работа 3 Методы исследования клеток микроорганизмов (техника приготовления микробиологических препаратов)

Цель работы: познакомиться с методами исследования микробных клеток, красителями, используемыми в микробиологической практике.

При изучении самой клетки или выявлении структур (капсул, спор), строения клеточной стенки или биохимических особенностей по определённым схемам используют разнообразные методы окрашивания – простые (используется один краситель) и сложные (используется несколько красителей, закрепители и протравители).

Краситель при окрашивании проникает в микробную клетку. Это даёт возможность рассматривать не только внешние признаки – форму клеток, размеры, капсулы, жгутики, но и некоторые особенности внутренней структуры – споры, включения, в некоторых случаях – нуклеоид.

В микробиологической практике используют основные и кислые красители. Клетки, как и нуклеоиды, окрашиваются основными красителями, реже – нейтральными. Кислые красители используют при окрашивании фона, что увеличивает контрастность неокрашенных форм.

Из основных (ядерных) красителей чаще применяют: красные – фуксин основной феноловый, сафранин, нейтральный красный; фиолетовые – метиловый фиолетовый, генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый; синие – метиленовый голубой или синий, азур II; зелёные – малахитовый зелёный, брильянтовый зелёный; жёлто-коричневые – везувин, хризоидин.

Из кислых (протоплазматических) красителей используют: красные – фуксин кислый, эозин, эритрозин, Конго красный; жёлтый – пикридиновую кислоту; черный – нигрозин.

Растворы красителей могут быть как водные, так и спиртовые. Спиртовые растворы красителей более стойкие. Водные растворы окрашивают медленнее.

Задание 1. Изучить методы окрашивания и их особенности.

Прижизненное (витальное) окрашивание

Взвесь микробов внести в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного и затем приготовить препарат «раздавленная капля». Микроскопировать ×600.

Негативный метод окрашивания

На предметное стекло нанести каплю 3% водного красителя Конго красного и в эту же каплю внести микробную массу, слегка перемешать. Смесь распределить по спирали со смещением. Мазок высушить на воздухе, не фиксировать. Микроскопировать ×1500.

На красно-коричневом фоне видны неокрашенные микробные клетки.

Цитохимический метод исследования

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля – Нильсена.

1. Фиксированный мазок окрасить карболовым фуксином через полоску фильтровальной бумаги с подогреванием до появления паров (1 раз) в течение 3–6 мин (не более 7 мин).

2. Снять бумагу и после охлаждения стекла мазок промыть водой (можно не промывать).

3. Обесцветить препарат 0,5% серной кислотой.

4. Промыть водой или 3–5% серной кислотой 5–7 сек.

5. Окрасить метиленовым синим 3–5 мин.

6. Промыть водой, высушить. Микроскопировать ×1500.

Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются серной кислотой и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, кислотоустойчивые, спиртоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет.