Получение элективной культуры протея

Цель работы: получить элективную культуру протея.

Протей (Proteus vulgaris) широко распространён в природе. Он часто встречается в недоброкачественном мясе, яйцах и других белковых продуктах. Накопление его в продуктах может стать причиной отравления человека. Наличие протея в продуктах свидетельствует о нарушении санитарных норм при разделке туш, обработке яиц, в местах торговли и т.д.

Особенностью протея является его активная подвижность, используемая для получения элективной культуры. Если материал, загрязнённый протеем, внести в конденсационную воду скошенного агара, то через сутки инкубации на поверхности агара можно обнаружить характерный тонкий, волнообразный, голубовато-серый налёт его «роения», «опережающий» сопутствующую флору.

Постановка исследования

Задание 1. В пробирку со скошенным МПА в конденсационную воду опустить кусочек несвежего мяса так, чтобы он не коснулся поверхности среды. Для этого пробирку держать горизонтально, агаром кверху, кусочек мяса пинцетом или бактериальной петлёй поместить на стенку пробирки и закрыть её пробкой.

Инкубировать при температуре 37 ^оС 24 часа.

Анализ исследования

Задание 2. Проанализировать и описать характер роста культуры. Приготовить микробиологический препарат, окрашенный по Граму. Микроскопировать ×1500. Оформить протокол исследования, описать микробную картину.

Вопросы для самопроверки

1. Каковы причины эндогенного и экзогенного обсеменения мяса микробами?

2. Каковы факторы, влияющие на развитие микробов при созревании мяса?

3. Что такое пороки мяса микробного происхождения и каковы причины, способствующие их развитию?

4. Что такое токсикоинфекция и токсикозы? Микробы, вызывающие токсикоинфекцию и токсикозы.

5. Возбудители каких инфекций передаются через мясо?

6. Что понимается под физическими и химическими методами консервирования мяса? Какие из них более надёжны?

7. Как и почему содержимое яиц поражается микробами?

8. Какие микроорганизмы вызывают гниение и плесневение яиц?

9. Яйцо какой птицы как источник заражения потенциально более опасно? Как проводят обеззараживание таких яиц?

10. Способы консервирования яиц, их положительные и отрицательные стороны.

Возбудители болезней, формирующие колонии на универсальных питательных средах

При выделении микроорганизмов возможен рост на универсальных средах возбудителей болезней, передающихся человеку от животных через молоко, яйца, мясо и другие пищевые продукты. Такими микроорганизмами являются:

1. Возбудитель сибирской язвы (Bacillus anthracis). Это крупная палочка, концы клеток которой, обращенные друг к другу, резко обрублены; чаще всего клетки располагаются цепочкой, но могут располагаться одиночно и попарно. По Граму палочка красится положительно, неподвижна. В организме образует капсулу, вне организма при наличии влаги, кислорода и при температуре 12–42 ^оС формирует внутри клетки спору овальной формы, располагающуюся в центре, не превышающую её диаметра. Аэроб. Вегетативные клетки погибают при 75 ^оС через 2–3 мин. Споры термоустойчивы: выдерживают кипячение в течение более часа и даже автоклавирование до 10 мин, десятки и сотни лет сохраняются в почве. Возбудитель образует сложный экзотоксин.

На МПА (ph 7,0–7,4) образует через 16–24 ч культивирования серовато-белые шероховатые или матовые с серебристым оттенком, локонообразными (состоят из длинных нитей, образуемых клетками возбудителя) краями колонии, напоминающие под лупой «головку медузы» или «гриву льва».

2. Возбудитель рожи свиней (Erysipelothrix insidiosa). Возбудитель поражает главным образом молодняк животных (3–12 мес.). Это тонкая, прямая или слегка изогнутая палочка длиной 1–1,5 мкм и шириной 0,2 мкм. Располагается одиночно, парами, иногда в виде нитей или небольшими кучками. Спор и капсул не образует, неподвижна, по Граму красится положительно. Факультативный анаэроб – микроаэрофил. Образует сероводород.

На МПА образует едва заметные круглые прозрачные колонии, напоминающие капельки росы.

3. Возбудитель листериоза (основной возбудитель Listeria monocytogenes). Листерии – мелкие полиморфные (иногда овоидной или кокковидной формы) палочки, по Граму красятся положительно, спор и капсул не образуют, подвижны. Температурный диапазон развития – 25–60 ^оС, оптимум – 30–37 ^оС, могут развиваться при 0 ^оС, не погибают при замораживании. Факультативный анаэроб. Не образуют сероводород, продуцируют каталазу.

Обладают высокой способностью приспосабливаться к окружающей среде: во льду сохраняют жизнеспособность 5,5 мес., в крепких солёных растворах (содержащих 30% соли) при температуре 4 ^оС – 2 мес.

Listeria monocytogenes выделена из многих пищевых продуктов, в том числе из мяса (в мороженых баранине сохраняется 20 дней, свинине – 14 мес.), колбас, сырого молока, мороженого, мягкого сыра, рисового супа, мороженых и консервированных омаров, крабов, салатов, разнообразных холодных закусок.

Заболевание характеризуется сепсисом (острым и хроническим), явлениями менингоэнцефалита, который в большом проценте случаев приводит к смертельному исходу. Встречаются лёгкие формы болезни и бактерионосительство.

На МПА формирует прозрачные, мелкие, округлой формы росинчатые колонии, края ровные.

При микроскопировании клетки располагаются в виде частокола или латинской буквы V и поодиночке.

4. Возбудитель сальмонеллёза (род Salmonella). Мелкие, короткие палочки с закруглёнными концами, тоньше кишечной палочки, длиной 2–3 мкм, шириной 0,6 мкм, подвижные (кроме одного вида), спор и капсул не образуют, грамотрицательные. Факультативные анаэробы. Температурный диапазон 5–46 ^оС, культивируют при оптимальной температуре 37 ^оС, но хорошо растут и при 18–20 ^оС, кислотность сред 7,2–7,6. При охлаждении до 0 ^оС сохраняют жизнеспособность в течение 142 дней, при кипячении гибнут мгновенно.

Сальмонеллы содержат термостойкие эндотоксины, которые, попадая с мясными и другими пищевыми продуктами в пищу, вызывают отравление у человека.

Сальмонелл выделяют из молочных продуктов, яйцепродуктов, мяса уток, гусей, кур, индеек, кремов, сливочного масла, студней, ливерных и кровяных колбас, варёных овощей, рыбопродуктов. Распространителями их могут быть мухи, мыши, крысы.

Сальмонеллёзная токсикоинфекция у человека проявляется через несколько часов после употребления заражённых продуктов. Острота и длительность заболевания различны. Некоторые из переболевших остаются бактерионосителями. Три основных типа сальмонеллёза – брюшной тиф, гастроэнтерит и септицемия.

На МПА сальмонеллы формируют круглые, выпуклые, гладкие, полупрозрачные, с ровными краями колонии. Со временем появляются слизистые валы.

5. Бактерии группы кишечных палочек – возбудители колибактериоза. К ним относятся роды Escherichia (E. coli), Citrobacter, Enterobacter. Бактерии представляют собой мелкие короткие палочки, в основном подвижные, грамотрицательные, не образующие спор и капсул. Факультативные анаэробы. Кислотность среды 7,2–7,4, оптимальная температура 30–37 ^оС, диапазон температур роста 5–46 ^оС, хорошо растут и при комнатной температуре. Рост кишечной палочки при температуре 43–46 ^оС позволяет выделить её из мяса и мясопродуктов, воды, молока и др. субстратов.

При нагревании до 60 ^оС E. coli погибает через 15–20 мин, при 75 ^оС – через 4–5 мин.

E. coli (кишечная палочка) – постоянный обитатель желудочно-кишечного тракта человека и теплокровных животных, выполняет в организме важную функцию – синтезирует витамины К, В, U и антимикробные вещества – колицины, воздействующие на сальмонеллы, шигеллы и другие патогенные бактерии. В то же время среди кишечных палочек встречаются варианты, способные вызывать острые кишечные заболевания. Они получили название энтеропатогенных кишечных палочек, образуют термостабильные эндотоксины, а некоторые штаммы образуют и экзотоксины, которые часто являются причиной острых желудочно-кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных, человека и особенно детей.

Пищевые токсикоинфекции, вызванные этим микробом, чаще всего связаны с употреблением мясных и молочных продуктов (готовые блюда из рубленого мяса, домашняя простокваша, кефир, творог) и блюд из сырых овощей и фруктов.

Во внешней среде кишечная палочка живет недолго, поэтому обнаружение её в различных пищевых субстратах говорит о свежем фекальном загрязнении.

На МПА бактерии кишечной палочки формируют выпуклые колонии круглой формы, с ровными краями, полупрозрачные, с серовато-голубоватым оттенком, со временем принимают серо-белый цвет.

Дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина, Плоскирёва) служат для дифференцировки бактерий рода Escherichia от сальмонелл. Эшерихии способны ферментировать лактозу. На среде Эндо кишечная палочка, разлагая лактозу до молочной кислоты, восстанавливает обесцвеченный сульфитом натрия индикатор (краситель – фуксин), образует колонии красного цвета с металлическим блеском. На среде Левина E. coli образует колонии чёрного цвета, на среде Плоскирёва – розового.

6. Бактерии рода Proteus. Это мелкие, коккоподобные, грамотрицательные палочки разной длины, иногда встречаются нитевидные формы, очень подвижные, спор и капсул не образуют. Факультативные анаэробы. Хорошо культивируются на простых средах с кислотностью 7,2–7,4 при оптимальной температуре 25–37 ^оС. Диапазон роста 5–43 ^оС. Выдерживают нагревание до 65 ^оС в течение 30 мин, pH – в пределах 3,5–12, отсутствие влаги – до 1 года, высокую концентрацию поваренной соли (13–17%) – в течение 2 суток. Обладают протеолитической способностью. Устойчивы к посолу (10–12% NaCl). Обитают в кишечнике человека и теплокровных животных. Два вида протея – P. vulgaris и P. mirabilis – вырабатывают кишечные яды – энтеротоксины. Чаще всего протей развивается в мясных, рыбных продуктах, особенно в измельчённых овощных гарнирах, салатах. Инкубационный период 4–20 ч.

На МПА колоний не формируют, а образуют вуалеобразный налёт, стелющийся по поверхности среды.

На среде Плоскирёва образуют изолированные полупрозрачные колонии средней величины.

7. Бактерии из рода Clostridium:

Cl. perfringens. Микроорганизм вырабатывает токсины. Это крупная, грамположительная, неподвижная, прямая, толстая палочка 2–6 мкм на 0,8–1,5 мкм, образует спору и капсулу. Спора чаще всего располагается субтерминально. Анаэроб. Культивируется при температуре 37–43 ^оС. Диапазон температур 6–50 ^оС, кислотности 6,0–7,5. Оптимальная температура 45 ^оС и кислотность среды 6,5 обеспечивают продолжительность генерации около 10 мин. Не развивается в кислой среде с кислотностью ниже 3,5–4,0 и в среде, содержащей 10–12% хлорида натрия. Споры выдерживают кипячение в течение 30–60 мин, а у отдельных штаммов – до 6 ч. Микроорганизм бурно ферментирует лактозу, но не образует каталазы.

Из шести типов один штамм – тип А – вызывает пищевые токсикоинфекции. Энтеротоксины высвобождаются из вегетативных клеток в период образования зрелых спор. Этот микроб является естественным обитателем кишечника человека и животных.

Из продуктов животного происхождения наибольшую обсеменённость имеют мясо и мясопродукты, молочные продукты (обсеменённые вегетативными клетками), рыба и морепродукты, а из растительных – мука, крупы, бобовые, пряности, зелень, свежие овощи (обсеменённые спорами).

Cl. botulinum – возбудитель ботулизма. Крупные палочки длиной 3,4–8,6 мкм и шириной до 1,3 мкм, подвижные до момента спорообразования, перитрихи, грамположительные, капсул не образуют, строгие анаэробы, споры расположены субтерминально – в виде теннисной ракетки, ложки, лодочки. Оптимальная температура роста 30–40 ^оС, pH 7,2–7,4. Споры при 100 ^оС сохраняют жизнеспособность в течение 6 ч, в спирте – в течение 2 мес., при 120 ^оС погибают через 10 мин, прорастают при концентрации хлорида натрия до 6–8%. Вегетативные клетки перестают развиваться и размножаться при pH 4,4 и температуре 10–12 ^оС и ниже, при 80 ^оС они погибают в течение 15 мин. Оптимальная температура для развития и размножения 20–37 ^оС.

Ботулотоксины (нейротоксин (самый сильнодействующий из известных в мире ядов) и гемолизин) характеризуются высокой устойчивостью к действию протеолитических ферментов, кислот и низких температур, однако инактивируются под влиянием щелочей и высокой температуры: при 80 ^оС – через 30 мин, при 100 ^оС – через 15 мин. Широко распространены в окружающей среде. Продукты растительного происхождения загрязняются через почву.

8. Бактерии из рода Bacillus. Bacillus cereus. Это крупная спорообразующая, грамположительная, подвижная палочка. Аэроб. Оптимальная температура культивирования 30–32 ^оС при кислотности 9–9,5, минимальная температура 5–10 ^оС. При pH 4,5–5 прекращает своё развитие. Бацилла устойчива к высокой концентрации соли (до 10–15%) и сахара (до 40–60%). Споры термоустойчивы и могут сохраняться в продукте не только при кулинарной обработке, но даже и при стерилизации консервов.

Bacillus cereus выделяют из различных продуктов животного и растительного происхождения, а также из ряда сухих продуктов – молока, яичного порошка, суповых концентратов.

Органолептические изменения не наблюдаются даже при накоплении в 1 г продукта 10⁵–10 ⁶ клеток.

Bacillus cereus продуцирует энтеротоксин, но отравление могут вызвать образовавшиеся под влиянием протеолитических ферментов этих бацилл продукты расщепления белка (например, токсичные амины). Инкубационный период от 4 до 16 ч, длительность заболевания 1–2 суток.

При культивировании на МПА образует крупные колонии с изрезанными краями или налёт белого цвета, иногда с мучнистой поверхностью.

При микроскопировании клетки располагаются в виде цепочек или пакетообразных скоплений, реже – отдельно друг от друга.

9. Бактерии из рода Staphilococcus. Аэробы и факультативные анаэробы. Бактерии неприхотливы к питательным средам. Культивируются при оптимальной температуре 32–37 ^оС, при кислотности среды 7,2–7,6. Развиваются при температуре от 10 до 43 ^оС. Оптимальная температура для размножения 22–37 ^оС. Стафилококки устойчивы к нагреванию: при 80 ^оС погибают только через 10 мин. Энтеротоксины Staphilococcus aureus (золотистый стафилококк) инактивируются после 2,5–3 ч кипячения. Данный вид обладает устойчивостью к концентрации поваренной соли – до 12%, сахара – до 60%, что необходимо учитывать при консервировании пищевых продуктов.

При культивировании бактерий на МПА через 12–24 ч появляются круглые, диаметром 2–4 мм, выпуклые, с ровными краями колонии цветов: белого – S. epidermidis (кожный), оранжевого – S. aureus (золотистый), лимонно-жёлтого – S. saprophyticus (сапрофитный). У некоторых штаммов колонии золотисто-жёлтого цвета.

Выделяют из молока, мяса, продуктов их переработки, мучных кондитерских изделий с заварным кремом, из других пищевых продуктов и кулинарных изделий.

У человека стафилококковая инфекция локализуется на кожных покровах, в носоглотке, кишечнике, других органах.

Стафилококк, находясь в молоке, продуцирует токсины при комнатной температуре через 8 ч, при температуре 35–37 ^оС – в течение 5 ч; в мясном фарше, сыром и варёном мясе при 22–37 ^оС – через 14–26 ч, а при добавлении в фарш хлеба скорость образования токсинов увеличивается в 2–3 раза, в готовых котлетах – через 3 ч, в печёночном паштете – через 10–12 ч; в кулинарных изделиях с заварным кремом – через 4 ч. Вакуумная упаковка мясопродуктов ингибирует рост стафилококков.

Патогенные и сапрофитные стафилококки имеют одинаковые морфологические и отчасти биохимические свойства, поэтому дифференциация патогенных стафилококков от непатогенных имеет большое практическое значение.

Таблица 4