20. Множественность точек начала репликации у эукариот. «Лицензирование» как механизм контроля согласованной активация точек начала репликации.

Для успешной и полной репликации, эукариоты начинают удвоение ДНК во многих точках начала репликации, которые распределены по хромосомам. Точки начала репликации расположены так, что вся ДНК может быть реплицирована в относительно короткий промежуток времени.

Каждая из точек репликации активируется раз и только раз в течение S-фазы.

Согласованная активация точек начала репликации контролируется с помощью механизма, называемого «лицензированием». При этом каждая точка начала репликации получает разрешение удвоиться только один раз в течение клеточного цикла. Удвоение каждой конкретной точки начала репликации «снимает лицензию», которая не может быть возобновлена до тех пор, пока клетка не осуществит весь цикл и не пройдет через митоз.

В удвоении полного генома человека принимает участие около 60.000 точек начала репликации.

Участок хромосомной ДНК, удвоение которого инициируется в одной точке начала репликации, получил название репликона. Точка начала репликации генетически определяется как репликаторный элемент. Начало репликации зависит от участия особых инициаторных белков (инициаторов), которые связываются с репликатором (точкой начала репликации) и, прямо или косвенно, способствуют плавлению дуплекса ДНК и предоставляя аппарату репликации доступ к двум отдельным цепям ДНК. В свою очередь, инициаторы связываются с дополнительными белковыми факторы, совместное действие которых порождает «волну» репликации ДНК, распространяющуюся в двух направлениях от точки начала репликации со скоростью 750–1250 нуклеотидов в секунду.

21.Точки начала репликации Saccharomyces cerevisiae. Аrs-элементы. Консервативные последовательности в составе ars-элементов.

В удвоении полного генома дрожжей принимает участие более 400 точек начала репликации – ARS-элементы (автономно реплицирующиеся последовательности). Репликация всегда начинается в пределах ARS-элементов, но не все ARS-элементы действуют как точки начала репликации. Каждая точка начала репликации может быть активирована с вероятностью 0,2-0,8. ARS-элементы имеют 2 особенности: 1) любой ARS-элемент имеет связующие сайты для белкового комплекса, который метит ARS-элемент как потенциальную точку начала репликации; 2) рядом со связующими сайтами есть последовательности, где происходит разделение пар оснований. ARS-элементы обладают общей последовательностью ДНК - ARS-кором (основная последовательность ARS). Особенность ARS-кора: одна замена основания по некоторым положениям в пределах этой последовательности полностью инактивирует весь ARS-элемент. Последовательность В1 вместе с ARS-кором формирует связующий сайт для комплекса ORC (комплекс узнавания точки начала репликации). Разделение цепей ДНК для инициации репликации происходит в пределах В2. Когда точка начала репликации инициирует удвоение ДНК, синтез дочерних цепей начинается между ORC-связующим сайтом и В2-элементом. ORC взаимодействует с последовательностью ARS-кора. Этот процесс требует присутствия АТФ. Связывание АТФ стабилизирует комплекс ORC, что позволяет ему принимать участие в инициации репликации ДНК. У дрожжей комплекс ORC постоянно связан с точками начала репликации на протяжении всего клеточного цикла. Последовательность В3 предназначена для связывания вспомогательного фактора ABF-1, который является активатором транскрипции и ARS-элементов. Фактор ABF-1 может быть заменен некоторыми другими факторами транскрипции.

22. ARS-кор, как основная (базовая) последовательность ARS-элементов. Белки ORC – основа формирования предрепликационных комплексов.

ARS-элементы обладают общей последовательностью ДНК, называемой основной (базовой) последовательностью ARS или ARS-кором. ARS-кор отличает важное свойство: одна единственная замена основания по некоторым положениям в пределах этой последовательности полностью инактивирует весь ARS-элемент. Другие менее консервативные последовательности в этом участке ДНК также влияют на активность ARS как точки начала репликации. Одна из них В1, вместе с ARS-кором, формирует связующий сайт для комплекса из шести белков, названного комплексом узнавания точки начала репликации (ORC). Первичное разделение цепей ДНК необходимое для инициации репликации происходит в пределах другой короткой последовательности В2. Когда точка начала репликации действительно инициирует удвоение ДНК, синтез дочерних цепей начинается в сайте двунапраленной репликации посередине между ORC-связующим сайтом и В2-элементом

Процесс взаимодействия ORC требует присутствия АТР, который остается связанным с комплексом ORC. Это стабилизирует комплекс ORC, что позволяет ему принимать участие в последующих процессах сборки предрепликационных комплексов. Ещё у дрожжей комплекс ORC постоянно связан с точками начала репликации на протяжении всего клеточного цикла.

В типичных случаях ARS-элементы содержат дополнительные сайты связывания для других, специфичных к определенным ДНК-последовательностям белков, таких как факторы транскрипции. Например, элемент ARS1 включает последовательность В3, которая взаимодействует с фактором транскрипции ABF-1. Но делетирование ABF-1-связующего сайта лишь незначительно снижает способность ARS1 действовать в качестве репликатора in vivo. Более того, сам фактор ABF-1 может быть заменен некоторыми другими факторами транскрипции.

Между точками начала репликации и промоторными элементами существуют важные функциональные взаимосвязи.