64. Плазмиды, классификация плазмид. Структура сайтов рестрикции эндонуклеаз типа II. «Тупые» и «липкие» концы.

Плазмиды — дополнительные факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или линейные молекулы ДНК.

Существует несколько систем классификации плазмид:

топологии (линейные или кольцевые), механизмах репликации, маркерных генов, содержащихся на плазмидах (например: устойчивость к антибиотикам, гены биодеградации ксенобиотиков, системы рестрикции — модификации, гены синтеза бактериоцинов и т. д. — или полному отсутствию оных — криптические плазмиды), круге хозяев,копийности, совместимости, конъюгативные (способные к переносу в другие клетки)/неконъюгативные.

Наиболее удобным принципом явл. классификация по наличию в них модульных сегментов ДНК. Каждый модульный сегмент может содержать один или несколько генов, или цис-действующих элементов таких, как, например, локус ori.

Функционально родственные модули в различных и независимо выделенных плазмидах часто оказываются и структурно родственными. Каждая плазмида должна иметь по крайней мере один репликационный модуль, который позволит ей активно размножаться в реципиентной клетке.Репликация и сегрегация (разделение) F-плазмид регулируются согласованно с репликацией бактериального генома, и в каждой клетке содержится одна или две копии плазмиды. О таком типе репликации говорят как о репликации со строгим контролем. Второй тип репликационного модуля свободен от такого контроля, что приводит к появлению в клетке многих копий плазмид. Подобный тип репликации получил название репликации с ослабленным контролем. Наличие других модулей, отличных от репликационных, не является обязательным для каждой конкретной плазмиды.

Свойства идеального плазмидного вектора. Идеальный плазмидный вектор для молекулярного клонирования должен удовлетворять следующим требованиям:

• вектор должен содержать минимальное количество ДНК;

• репликация вектора должна регулироваться по типу ослабленного, а не строгого контроля, чтобы обеспечить высокий выход ДНК;

• вектор должен содержать не менее двух селективных маркеров и иметь один сайт узнавания для рестриктирующей эндонуклеазы. Последнее свойство позволяет разрезать кольцевую ДНК в уникальном сайте, по которому впоследствии осуществляют лигирование со вставкой;

• для максимально простого отбора трансформантов, уникальный сайт рестрикции должен располагаться в пределах одного из двух селективных маркеров;

• вставка не должна прерывать последовательность, необходимую для сохранения самой плазмиды.

Первый класс рестриктаз включает ферменты, проявляющие активности  типа. Среди рестриктаз типа II наиболее полно изучена рестриктаза Eco RI. Фермент отвечает только за акт рестрикции.

Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. Выступающие участки двух образующихся фрагментов комплементарны друг другу. Ввиду продольной асимметричности молекулы ДНК, концы её цепей неравнозначны. Они обозначаются 3' и 5' в соответствии с нумерацией атомов в 2-R-дезоксирибофуранозиде.

могут образовываться липкие концы с 5'-выступающими и 3'-выступающие липкие концы, когда неспаренные нуклеотиды заканчиваются 3'-концом

Тупые концы образуются, в случае, когда разрезание ДНК происходит строго по оси симметрии узнаваемой последовательности (пример эндонуклеазы рестрикции с такой специфичностью — EcoRV).