47. Представления об интронах группы I как о рибозимах. Самосплайсинг рРнк Tetrahymena thermophila.

Интрон в молекуле предшественника рРНК, обнаруженный у Tetrahymenathermophilа, оказался способным катализировать собственное удаление из этого предшественника и кроме этого может направлять множественные РНК-зависимые реакции расщепления/воссоединения и может даже действовать на другие молекулы РНК. Он был назван рибозимом. Этот интрон впоследствии стал прототипом для целого семейства самосплайсирующихся РНК - интроны группы I (пре-рРНК у одноклеточных эукариот, пре-мРНК митохондрий и хлоропластов многих низших организмов и в митохондриях высших растений).

Различные представители семейства РНК группы I имеют консервативную третичную структуру (соответствующие связи располагаются в непосредственной близости, делая возможным автономное осуществление реакций разрыва и сшивания этих связей) способную обеспечить проведение двух реакций расщепления фосфодиэфирных связей. Одним из уникальных свойств самосплайсинга является потребность в нуклеотиде, содержащем гуанин (ГТФ, ГДФ, ГМФ), что свидетельствует о том, что самосплайсинг не связан с энергетическими потребностями. Единственное необходимое условие – нуклеотид гуанина должен содержать свободную 3`-гидроксильную группу.

5^/-сайт сплайсинга атакует гуанозин, входящий в состав GTP, GDP или GMP (атакует границу первого экзона и интрона и высвобождает экзон с образованием 3^/-конца). Затем образовавшаяся 3^/-ОН-группа экзона атакует 3^/-сайт сплайсинга соединяя при этом два экзона. Для складывания интрона в третичную структуру требуется большое количество ионов Mg²⁺,которые обеспечивают удерживание в непосредственной близости 5^/- и 3^/-концов экзонов для последующего их соединения благодаря спариванию оснований во «внутренней направляющей последовательности» интрона.

Единственными условиями для процесса сплайсинга молекул РНК группы Iinvitro является присутствие внешнего источника ионов Mg²⁺ и добавленного гуанозина. Однако в условиях invivo вполне вероятно, что сплайсинг интронов группы I нуждается во вспомогательном действии специфических белков.

48. Интроны группы II – второй класс самосплайсирующихся интронов. Явление рнк-интерференции и редактирование рнк.

Интроны группы II обнаружены только в митохондриях и хлоропластах растений и у грибов, также в генах некоторых тРНК и рРНК. Интроны группы II складываются во вполне определенную третичную структуру. В нефизиологических условиях способны к самостоятельному выщеплению себя из первичных молекул РНК в отсутствие любых белков. Реакции трансэтерификации выполняемые интронами группы II в точности соответствуют реакциям сплайсинга молекул пре-мРНК в ядре.

Внутримолекулярная вторичная структура интронов группы II формирует каталитический центр, который схож с межмолекулярным спариванием оснований малых ядерных РНК в сплайсисоме. В ходе эволюции каталитически активные элементы интронов группы II могли быть удалены из состава интронов и разделиться на несколько самостоятельных малых ядерных РНК.

Эффект подавления экспрессии определенных генов малыми РНК получил название РНК-интерференции, а молекулы, вызывающие его малыми интерферирующими РНК – siRNA.

Появление их в клетках заметили в результате проведенных опытов на растении петунии и дождевом черве. Вводя в клетки дополнительные копии генов, чтобы усилить их работу, наблюдали противоположный эффект- полное их замолкание.

siRNA состоят всего из 21-28 (у млекопитающих из 21-23) нуклеотидов. В отличие от других РНК, они являются двухцепочечными. Нуклеотиды двух цепей siRNA спариваются друг с другом по законам комплементарности. По двум 3’ концам siRNA присутствуют одноцепочечные выступы из двух неспаренных нуклеотидов.

Попав в клетку siRNA взаимодействует со специфической клеточной системой белков. Сначала с siRNA связываются ферменты геликаза и нуклеаза, формируя комплекс RISC (от англ.– замолкание). Геликаза раскручивает цепи siRNA и они расходятся. Одна из этих цепей, связанная с нуклеазой, связывается с комплементарным ей участком одноцепочечной мРНК, позволяя нуклеазе разрезать ее. Разрезанные участки мРНК подвергаются действию других клеточных РНКаз, которые обеспечивают их дальнейшую деградацию. Тем самым с помощью siRNA клетка может защитить себя от проникновения вирусов.

Растения и насекомые изобрели другой путь защитного действия siRNA. Присоединяясь к цепи мРНК, участок siRNA с помощью специфического комплекса ферментов DICER, сначала достраевает вторую цепочку мРНК, а затем разрезать ее в разных местах, создавая «вторичные» siRNA. Они формируют комплексы RISC и обеспечивают полную деградацию чужой(вирусной мРНК). Т.о. благодаря «вторичным» молекулам резко усиливается эффективность клеточной защиты. Т.о. siRNA выполняет роль «внутриклеточного иммунитета», позволяющего распознавать и быстро уничтожать чужую РНК.

Короткие РНК были созданы, чтобы защитить нас от нас самих. 34% из всего материала в хромосомах человека - элементы LINEs и SINEs, которые могут перемещаться с одного места хромосомы в другое (мобильные генетические элементы). Т.о. они могут стать причиной внутриклеточного хаоса, способны индуцировать рак; изменять структуру хромосом, что приведет к мутациям. Полагают, что siRNA способна управлять таким поведением.

Термин редактирование РНК описывает действия событий посттранскрипционного процессинга, в ходе которых изменяется первичная последовательность молекул РНК. Они включают как модификацию нуклеотидов, так и процессы их встраивания/делетирования.

Изменение нуклеотидов. В составе мРНК один из С заменяется на U, превращая тем самым кодон глутамина САА в терминирующий кодон UАА, что прерывает трансляцию такой мРНК на «середине пути». Такой тип редактирования РНК является результатом дезаминирования С катализируемого специфической дезаминазой. Другие виды редактирования РНК включающие модификацию нуклеотидов в клетках эукариот являются результатом проявления активности аденозин-дезаминазы селективно превращающей остатки А в I в составе двухцепочечных участков некоторых РНК.

Вставки и делеции нуклеотидов. Впервичные РНК-транскрипты митохондрий либо происходит встраивание остатков U в точно определенные сайты молекул РНК, либо, иногда (реже), происходит их удаление из этих РНК. Эти события способствуют появлению инициирующих кодонов AUG, появлению терминирующих кодонов, корректируют мутации со сдвигом рамки считывания и могут даже создавать множество последовательностей, кодирующих белки.