66. Способы получения днк для клонирования.

Цель многих экспериментов по клонированию состоит в синтезе нужного полипептида. Синтез белков, предназначенных для проведения тех или иных исследований или для применения в медицине и фармацевтической промышленности – это одна из самых первых задач, которые ставились при разработке технологии рекомбинантных ДНК. В настоящее время даже ряд ферментов, используемых для конструирования рекомбинантных молекул ДНК, в свою очередь является продуктом синтеза под контролем генов, клонированных в плазмидных векторах E. coli. Получаемые препараты имеют высокую степень чистоты, относительно недороги и включают ДНК-полимеразу I, ДНК-лигазу E. coli, обратную транскриптазу. С помощью методов клонирования были синтезированы важные в клиническом отношении белки, которые трудно было получать иным путем. Сюда относятся интерфероны, инсулин и гормон роста человека. Были синтезированы белки, кодируемые вирусом гепатита В и возбудителем малярии человека, которые использовались в качестве антигенов в некоторых вакцинах.

ДНК для клонирования может быть получена несколькими способами:

1) если полипептид состоит из небольшого числа аминокислотных остатков, наиболее простым и доступным способом получения ДНК является ее химико-ферментативный синтез;

2) применение обратной транскриптазы (в случае доступности зрелой иРНК, обратная транскрипция которой позволяет получать лишенную интронов кДНК); этот вариант клонирования используется преимущественно в тех случаях, когда возникает необходимость получения белковых продуктов с достаточно высокой молекулярной массой, что затрудняет химический синтез соответствующих молекул ДНК вследствие его трудоемкости и длительности, а также высокой стоимости;

3) непосредственное расщепление геномной ДНК под действием подходящей рестрикционной эндонуклеазы.