18.Локус oriC – точка начала репликации. Структура локуса oriC. Предзатравочный комплекс. Роль белков dnaА, hu, dnaС и dnaВ в формировании предзатравочного комплекса.

Точка начала репликации ДНК E. coli, обозначаемая oriC, включает 245 пар оснований: локус ori включает элементы ДНК-последовательностей, которые являются высококонсервативными для всех точек начала репликации у бактерий.

Ключевые последовательности в области точки начала репликации представлены двумя сериями повторов: тремя повторами из 13 пар оснований и четырьмя повторами из 9 пар оснований. Как следует из табл. С в фазе инициации репликации принимают участие, по меньшей мере, 9 различных ферментов и белковых факторов. Эти ферменты и белки раскрывают спираль ДНК в точке начала репликации и формируют предзатравочный комплекс. Ключевым компонентом инициации является белок dnaA.

Белковый комплекс из 4-5 молекул инициаторного белка dnaA взаимодействует с каждым из четырех повторов из 9 пар оснований в точке начала репликации и обеспечивает плавление ДНК в области трех повторов из 13 пар оснований, которая обогащена А-Т парами. Этот процесс требует участия АТР и бактериального гистоноподобного белка HU. После этого белок dnaC обеспечивает взаимодействие белков dnaВ с денатурированной областью ДНК. Белки dnaВ в виде кольцеобразных гексамеров связываются с каждой цепью ДНК и действуют как геликазы расплетая двойную спираль и формируя две потенциальные репликативные вилки.

Если при этом в условиях in vitro в систему репликации добавить SSB-белки и ДНК-топоизомеразу II (ДНК-гиразу) E. coli dnaВ-геликазы с большой скоростью начнут разделять тысячи пар оснований двигаясь в противоположных направлениях от точки начала репликации.

Белок dnaA- Узнает специфические последовательности oriC. Открывает дуплекс ДНК в локусе ori. Белок dnaB (геликаза)- Разделяет цепи ДНК. Белок dnaC- Участвует в связывании dnaB в точке начала репликации. HU- Гистоноподобный белок; ДНК- связывающий белок; стимулирует инициацию репликации.

19. Регуляция инициации репликации днк e. Coli. Dam-метилаза. Последовательности gatc. Терминация репликации.

Инициация.Точка начала репликации ДНК E. coli, обозначаемая oriC, включает элементы ДНК-последовательностей, которые являются высококонсервативными для всех точек начала репликации у бактерий.

В фазе инициации репликации принимают участие 9 различных ферментов и белковых факторов. Фаза инициации репликации ДНК является единственной стадией всего процесса, которая регулируется так что удвоение ДНК происходит только один раз в каждом клеточном цикле. Установлено, что на выбор времени начала репликации влияет метилирование ДНК и ее взаимодействие с бактериальной плазматической мембраной. Участок ДНК метилируется специфической Dam-метилазой, которая вводит метильную группу по N⁶-положению аденина. В норме GATC-палиндромы полностью метилированы. Сразу после удвоения ДНК в точке начала репликации данные участки становятся полуметилированными: родительские цепи - метилированные, но вновь синтезированныее дочерние цепи ДНК неметилированные . Полуметилированное состояние становится сигналом для его взаимодействия с плазматической мембраной бактериальной клетки и изолирования этой точки начала репликации от повторной ее активации. Спустя определенное время последовательность высвобождается из взаимодействия с плазматической мембраной и снова полностью метилируется с участием Dam-метилазы, получая, тем самым, возможность активироваться для следующего цикла репликации.

Терминация. Две репликативные вилки встречаются в области терминатора, который представляет собой последовательность, состоящую из множества повторов, построенных из 20 пар оснований.Формируется «ловушку», в которую репликативная вилка может попасть, но не может ее покинуть. Механизм функционирования Ter-последовательности заключается в том, что она является сайтом связывания специфическо белка. Этот комплекс способен замедлить движение репликативной вилки только в одном направлении, данный комплекс сначала сталкивается с любой репликативной вилкой. Когда любая из двух репликативных вилок наталкивается на функционально активный комплекс, она приостанавливается, вторая репликативная вилка останавливается при встрече с первой вилкой. Несколько сотен последних пар оснований расположенных между двумя встретившимися крупными ферментными комплексами удваиваются с помощью еще неизвестного способа, завершая тем самым образование двух сцепленных кольцевых хромосом.