39. Промоторы эукариот. Блок Хогнесса. –70-блок.
Промотор – специальная регуляторная последовательность ДНК, необходимая для правильного взаимодействия с РНК-полимеразой и точного начала транскрипции. В промоторах эукариот были выделены три структурныхучастка, в которых обнаруживается значимая гомология. Этими участками являются:
стартовая точка;
участок, расположенный в районе – 25 против хода транскрипции;
и участок в районе положения – 75 против хода транскрипции.
В зависимости от типа используемой РНК-полимеразы различают промоторы генов класса I, класса II и класса III.
-Класс I:Промоторы генов класса I включают левый регуляторный элемент, расположенный на расстоянии 100 п.н. от стартовой точки генов пре-рРНК. Два фактора транскрипции – UBF и SL1 связываются с регуляторным элементом промотора и стабилизируют инициирующий комплекс.
-Класс II:Гены класса II транскрибируются с помощью РНК-полимеразы II. Регуляторные последовательности промоторов генов этого класса включают:
ТАТА-бокс (блок Хогнесса); СААТ-бокс; ГЦ-бокс; цис-элементы; Энхансеры; Сайленсеры.
-Класс III :Внутренние элементы промотора (А-бокс и В-бокс) находятся во всех генах тРНК. Два транскрипционных фактора необходимы для инициации транскрипции всех генов тРНК: TFIIIC и TFIIIB.
Промоторы разных генов эукариот довольно разнообразны по нуклеотидному составу. Однако, почти для всех промоторов генов эукариот класса II характерно наличие консервативной последовательности из 7 оснований на расстоянии 19-27 нуклеотидов слева от точки инициации транскрипции. Это так называемый блок Хогнесса, который обеспечивает корректное расположение РНК-полимеразы по отношению к стартовой точке. Распологается предпочтительно в положении -25. Данная каноническая последовательность состоит в основном из пар А-Т и окружена последовательностями, богатыми G-C.
Далее против хода транскрипции имеется другая консервативная последовательность, расположенная между положениями -70 и -80. Иногда эта последовательность обозначается как СААТ-блок.-70 блок вызывает снижение частоты инициации в обычной стартовой точке приблизительно до 2% от первоначального уровня.
40.Закрытый и открытый двойные комплексы. Тройной комплекс. Роль σ-фактора.
РНК-полимераза –это белковый комплекс, который называется полный фермент, или холофермент. Состоит из двух α, одной β, β’,ω-субъединиц и фактором σ. Холофермент можно разделить биохимическими методами на минимальный фермент (кор-фермент)(2αβ,β’ω) и σ-фактор. Только полный фермент может инициировать транскрипцию, далее σ-фермент высвобождается и собственно элонгация осуществляется с участием кор-фермента.
Основная функция σ-фактора – обеспечить узнавание и стабильное связывание РНК-полимеразы с промоторами, а не со случайными участками ДНК. Снижение сродства РНК по отношению к участкам ДНК не имеющих промоторов в 104 раз, что также способствует специфической инициации транскрипции. Участвует в раскрывании двойной спирали ДНК.
Взаимодействие холофермента с промотором начинается с образования двойного закрытого комплекса, который затем переходит в двойной открытый комплекс. При этом происходит плавление небольшого участка ДНК, что приводит к образованию прочного связывания. После образования двойного открытого комплекса происходит включение двух первых нуклеотидов с образованием фосфодиэфирной связи между ними. В результате формируется тройной комплекс, включающий минимальный фермент, ДНК и синтезирующуюся РНК. На этой стадии σ-фактор отделяется от РНК-полимеразы. Когда транскрипция заканчивается, минимальный фермент отделяется от ДНК в виде свободного белкового тетрамера. Свободный кор-фермент затем должен найти другой σ-фактор и включиться в следующий цикл транскрипции.
