65. Трансформация, трансфекция, клонирование.

Процесс введения рекомбинантной плазмиды в реципиентную клетку получил название трансформации. Было показано, что в присутствии СаCl₂ устойчивые клетки становятся проницаемыми для ДНК и их трансформация с помощью плазмидной ДНК осуществляется всего за несколько минут. При инкубации клеток E. coliК12 с плазмидой pBR322 может образоваться более 10⁸ успешно трансформированных клеток на 1 мкг плазмидной ДНК в зависимости от используемого штамма и конкретных условий.

Большим преимуществом использования -векторных молекул ДНК для молекулярного клонирования является высокая эффективность переноса рекомбинантных геномов в клетки E. coliК12. Теоретически ДНК фага  дикого типа может дать при трансфекции примерно 2 10¹⁰ бляшкообразующих единиц на 1 мкг ДНК. Однако клетки, обработанные СаСl₂ и трансфицированные с помощью изолированной ДНК фага  способны образовать только 10⁴-10⁶ бляшек на 1 мкг ДНК.

Cреди бактериальных клеток, подвергшихся трансформации, только небольшая их часть оказывается трансформированной. Отделение истинных трансформантов от общей массы клеток выполняется в процессе клонирования. Операция заключается в посеве разбавленной бактериальной суспензии на твердую питательную среду, например, на агар в чашке Петри таким образом, чтобы на 1 см² поверхности агара приходилось 5 – 10 клеток бактерий. Каждая бактериальная клетка начинает делиться, и в конечном счете образуется семейство ее потомков в виде маленькой колонии. Эта колония называется клоном, так как все клетки ее составляющие происходят от одной родительской клетки.

Если в качестве вектора используется плазмида pBR322, то для отбора бактерий-трансформантов в питательную среду добавляют антибиотики – ампициллин или тетрациклин. На среде с ампициллином клоны образуют все клетки, которые несут плазмиду. Для идентификации клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду, часть материала каждого клона переносится методом отпечатков на другую чашку Петри, содержащую тетрациклин, ген устойчивости к которому у части клеток разрушен вставкой. На этой чашке Петри клоны дают только те бактерии, которые содержат исходную нерекомбинантную плазмиду pBR322. Сравнивая расположение клонов на первой и второй чашках Петри легко узнать колонии, содержащие рекомбинантный вектор. Отбор по определенному биологическому признаку, в данном случае по устойчивости к антибиотику, называется селекцией.

Клонирование при использовании в качестве вектора ДНК бактериофага  осуществляют посредством посева на чашку Петри трансфицированных в присутствии CaCl₂ или инфицированных клеток E. coli так, чтобы на 1 см² поверхности приходилось от 5 до 10 бактериальных клеток. Клетки, не содержащие фаговой ДНК, размножаются на агаре и дают мутный ровный «газон», заполняющий всю поверхность агара. Однако в тех точках, куда попали бактерии, включившие рекомбинантную фаговую ДНК, остаются прозрачные концентрические просветы – негативные колонии (бляшки).