25. Рестриктазы типа 2(класс 1). Характеристика рестриктазы Eco r1. Природа сайтов узнавания и рестрикции. «Липкие» и «тупые» концы.

Рестрикц.ферменты разделяются на два класса по механизму действия. В пределах двух классов рестриктазы подразделяются на более мелкие группы – рестриктазы типа I, II и III.

Первый класс рестриктаз включает ферменты, проявляющие активности  типа. Среди рестриктаз типа II наиболее полно изучена рестриктаза Eco RI. Данный фермент отвечает только за акт рестрикции; Собственно рестриктаза Eco RI представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субъединиц c молекулярной массой 31.000 Да.

Были получены кристаллы комплекса Eco RI и олигонуклеотида 5′-TCGCGAATTCGCG-3′ и проведен их рентгеноструктурный анализ. Это позволило в деталях выяснить способ взаимодействия данного фермента с ДНК. В частности было показано, что между двумя остатками Arg и одним остатком Glu, с одной стороны, и парами оснований в сайте узнавания – с другой, образуются водородные связи, в результате чего происходит частичное раскручивание В-ДНК, облегчающее последующее разрезание.

В качестве сайтов рестрикции для рестриктаз типа II часто выступают последовательности из 4-6 пар оснований, представляющие собой в ряде случаев палиндромы, которые имеют также симметричную модификацию -метилирование соответствующих оснований в обеих цепях ДНК.

Поэтому сайт-мишень может быть полностью метилирован (обе цепи молекулы ДНК модифицированы), полуметилирован (модифицирована только одна цепь) и неметилирован. Полностью метилированный сайт не подвержен ни рестрикции, ни модификации. Полуметилированный сайт не узнается рестриктазой, но может быть превращен под действием метилазы в полностью метилированный. Неметилированный сайт-мишень представляет собой субстрат для действия как рестриктазы, так и метилазы, и может быть либо разрезан, либо метилирован.

Большинство рестриктаз типа II разрезают ДНК в неметилированных сайтах, причем, некоторые ферменты вносят ступенчатые разрывы с образованием «липких» концов, тогда как другие рестриктазы II типа вызывают образование тупых концов. Характерными особенностями рестриктаз II типа являются:1)совпадение сайта узнавания и сайта рестрикции,2)полное разобщение рестриктирующей и метилирующей активностей.

26. Молекулярная основа мутаций. Точечные мутации. Транзиции и трансверсии. Горячие точки. Молчащие мутации. Нейтральные мутации.

Необходимым свойством структуры ДНК является высокая стабильность содержания в ней азотистых оснований и их последовательности. Однако, могут возникать изменения и ошибки в ДНК. Ошибки могут возникать в процессе репликации или рекомбинации, вызывая встраивание одного или нескольких дополнительных оснований в новую цепь.

Необратимые изменения в структуре ДНК получили название мутаций.

В процессе мутагенеза любая пара оснований может мутировать. Изменения, которые затрагивают только одну пару оснований, называют точечными мутациями. Точечные мутации могут быть двух типов. К 1-му типу точечных мутаций относят замены одного пурина на другой пурин, или одного пиримидина на другой пиримидин и называют такие мутации транзициями. Примером транзиции может служить замена пары C-G на T-A или наоборот. Это наиболее часто встречающийся тип точечных мутаций. Ко 2-му типу точечных мутаций относят трансверсии, которые характеризуются заменами пурина пиримидином и наоборот, т.е. пара A-T превращается в T-A или C-G.

Одной из возможных причин точечных мутаций, относящихся к транзициям является химическое превращение одного основания в другое. Другой возможной причиной транзиций может быть ошибочное спаривание оснований, приводящее к образованию неканонических пар и, следовательно, к искажению двойной спирали ДНК.

Основным типом мутаций в индивидуальных генах являются точечные мутации. Однако, в настоящее время известно, что, по крайней мере, у бактерий очень часто происходят вставки (инсерции) дополнительного материала или выпадение (делеции) части или целой вставки, а иногда и соседних с вставками участков ДНК.

Генетические и биохимические исследования показали, что возникающие мутации локализуются вовсе не равномерно по всему геному. В некоторых сайтах происходит гораздо больше мутаций, чем следует ожидать при их случайном распределении. Такие сайты называют горячими точками.

Сайты одних типов являются горячими точками для спонтанных мутаций и мутаций, индуцированных одними мутагенами, тогда как другие мутации возникают в результате действия других мутагенов.

Мутации, не приводящие к заметным изменениям фенотипа, называют молчащими мутациями. Молчащие мутации могут быть двух типов:

1)В первом случае замена одного основания на другое не приводит к замене аминокислоты в белке;

2) Во втором случае замена основания в ДНК вызывает замену соответствующей аминокислоты в белке, но эта замена аминокислоты не влияет на функциональные свойства белка. Молчащие мутации второго типа называют нейтральными мутациями.