49. Экспериментальная расшифровка генетического кода. Синтетические олигонуклеотиды. Метод связывания рибосом.

Теоретический анализ явления колинеарности нуклеотидных и аминок- ых последовательностей привели к предположению, что наиболее подходящей по размеру для генетической кодирующей единицы, или кодона, является последовательность из 3 нуклеотидов. В нуклеотидной последовательности должно быть достаточно кодирующих единиц, чтобы зашифровать 20 АК. Кодовое отношение должно быть больше единицы. Специфичность одной АК должна быть детерминирована более чем одним основанием. Если генетический код триплетен, каждой АК должны соответствовать 3 расположенных рядом основания. Впервые Крик и Бреннер экспериментально показали триплетную природу кода, на мутантах фага Т4 с делециями или вставками. Мутации приводили к образованию аномальных белков с нарушенной функцией. Если добавляется или удаляется нуклеотид, то происходит сдвиг рамки считывания, а это ведет к появлению новой послед-ти кодонов, которая будет кодировать послед-ть АК. Генетический код читается в виде неперекрывающихся триплетов с фиксированной стартовой точки.

Предпосылки для постановки экспериментов по расшифровке кода: 1) было установлено, что иРНК- информационный посредник между генами и белками. 2) иРНК, введенная в бесклеточны бактериальные экстракты, транслируется с образованием соответствующих белков. Для этого использовали систему белкового синтеза. Суть эксперимента в том, что клетки E. Coli разрушали, фрагменты оболочек и плазматических мембран удаляли центрифугированием, ДНК деградировали добавлением ДНКазы.

Синтетические полинуклеотиды стали применять для синтеза полипептидов после того, как Ниренберг и Маттеи сделали вывод о том, что триплет UUU кодирует АК фенилаланин. Полинуклиотидтрифосфоты получали ферментативным путем с помощью полинуклеотидфосфорилазы, которая обазует РНК-подобные полимеры из АДФ, ЦДФ, УДФ, ГДФ. Фермент не нуждается в матрице и не способен синтезировать полимеры со специфическими нуклеотидными последовательностями.

Затем стали использовать гетерополимеры, способных направлять включения в полипептид нескольких АК. РНК также синтезируется с помощью полинуклеотидфосфорилазы, но ее состав зависит от относительных концентраций 5`-дифосфатов, присутствующих в реакционной смеси. Исходя из этого можно вычислять ожидаемую встречаемость тех или иных триплетов. Анализ частоты включения АК в полипептид, образующийся в системе трансляции invitro показал, что в наибольшей степени включается Phe, так триплетUUU встречался чаще всего. Используя различные гетерополимеры, удалось определить состав триплетов, соответствующих каждой из 20 АК.

Но эти эксперименты в большинстве случаев позволяли определить лишь состав триплетов, но не последовательность нуклеотидов. Эта проблема была решена с помощью зависимого от кодона специфического связывания молекул тРНК с рибосомами.

Метод связывания рибосом. Его суть: связавшиеся с рибосомами молекулы аминоацил-тРНК задерживаются на фильтре, а не связавшиеся аминоацил-тРНК проходят через фильтр. Определить какая из 20 меченых ¹⁴С аминоацил-тРНК взаимодействует с мембраной, и зная, какова послед – ть тринуклеотида в комплексе, легко установить кодовое слово для данной АК.