62. Способы соединения фрагментов днк invitro. Метод линкеров. Коннекторный метод.

Возможность проведения различных манипуляций с ДНК invitro зависит от наличия высокоочищенных ферментов, кот-е способны специфически разрезать, модифицировать и соединять фрагменты ДНК.

Основным инаструментом при конструировании рекомбинантных молекул ДНК и при анализе структуры ДНК явл. рестриктирующие эндонуклеазы типа II. Особенностью рестриктаз является их способность действовать только на двухцепочечные молекулы ДНК. Они узнают короткие нуклеотидные послед-ти и связываются с ними; они производят двухцепочечные разрезы по фосфодиэфирным связям, в результате образуются 5`-фосфатная группа и 3`-гидроксильная группа.

Метод линкеров: чтобы придать фрагменту нуклеиновой кислоты необходимые для встраивания в определенный участок векторной молекулы «липкие» концы, синтезируются т.н. линкеры. Линкеры – двухцепочечные олигонуклеотиды, которые содержат какую-либо послед-ть, расщепляемую той или иной рестрикционной эндонуклеазой.

Типы линкеров:

Самокомплементарный линкер длиной 8-10 нуклеотидных звеньев

Напр,: 5`pGGAATTCC 3`

3` CCTTAAGGp 5`

Адапторные линкеры – частично двухцепочечные олигонуклеотиды, содержащие «липкие» концы, соответствующие двум разным рестрикционным эндонуклеазам. (когда необходимо заменить один тип «липких» концов на другой).

Дополняющие линкеры – позволяют перейти от «тупого» конца ДНК к «липкому», что облегчает процесс рекомбинации.

Коннекторный метод: с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы к «тупым» 3`-концам одного фермента присоединяется гомодезоксиполинуклеотид (напр, poly(dT) или poly(dC)), а к «тупым» 3`-концам другого фермента – полинуклеотид, комплементарный используемому в первом случае, т.е. poly(dА) или poly(dG) соответственно.

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не способна инициировать синтез новой полимерной цепи и поэтому требует присутствия праймера со свободной концевой 3`-ОН-группой. Этот фермент не нуждается в матрице; не способен к копированию нуклеотидных последовательностей. Продуктом синтеза является одноцепочный полимер. Поэтому для присоеднинения гомонуклеотидов к двухцепочечному фрагменту ДНК, необходимо использовать дополнит-е методы, позволяющие получать одноцепочечные концы, способные служить праймером.

63.Понятие вектора. Векторы в генетической инженерии. Свойства «идеального» вектора.

Молекулы ДНК, используемые для переноса встроенного материала в бактериальные клетки, называют векторами. Такое встраивание осуществляется invitro, а затем полученные рекомбинантные ДНК вводят в клетки. Вектором может быть внехромосомный элемент – плазмида, ДНК фага или ДНК-вируса

Плазмидные векторы. Каждая плазмида должна иметь хотя бы один репликационный модуль, который позволит ей активно размножаться в реципиентной клетке. Если репликация и разделение F-плазмид регулируются согласованно с репликацией бактериального генома, и в каждой клетке содержится одна или две копии плазмиды - репликации со строгим контролем. Второй тип репликационного модуля свободен от контроля, что приводит к появлению в клетке многих копий плазмид - репликации с ослабленным контролем. Половые факторы - коньюгативными плазмидами, например F-фактор, имеют модули, содержащие гены и регуляторные области, необходимые для переноса плазмиды из одной клетки в другую. Плазмиды, несущие другие модули - гены, белковые продукты которых обеспечивают инактивацию антибиотиков, называют R-плазмидами. Плазмиды, несущие Col-модули (гены, кодирующие один из нескольких белков – колицинов – антибактериальных агентов, продуцируемых бактериями) называются col-плазмиды. Свойства идеального плазмидного вектора: 1)вектор должен содержать минимальное количество ДНК; 2)репликация вектора должна регулироваться ослабленным контролем, для обеспечения высокого выхода ДНК; 3)вектор должен содержать не менее двух селективных маркеров и иметь один сайт узнавания для рестриктирующей эндонуклеазы. Последнее свойство позволяет разрезать кольцевую ДНК в уникальном сайте, по которому впоследствии осуществляют лигирование со вставкой; 4)уникальный сайт рестрикции должен располагаться в пределах одного из двух селективных маркеров; 5)вставка не должна прерывать последовательность, необходимую для сохранения самой плазмиды.

Фаговые векторы более эффективны, чем плазмидные, особенно при клонировании крупных вставок, и скрининг большого числа негативных колоний на содержание вставки провести проще, чем скрининг большого количества бактериальных колоний. У E. coli– фаги  и М13.

Космиды - один из типов гибридных векторов, характеризуются плазмидным типом репликации, способны упаковываться в условиях invitro в головки фага . Типичная космида содержит область начала репликации, включает уникальные сайты рестрикции и селективные маркеры, принадлежащие плазмидной ДНК, которая объединена с фрагментом ДНК фага , содержащим фаговые «липкие» концы (cos-cайты).

Фазмиды - линейные дуплексные молекулы ДНК, на концах которых расположены сегменты ДНК фага , содержащие все гены, требующиеся для литической инфекции, а средняя часть представлена линеаризованной плазмидой. Обычно такие векторы содержат несколько тандемных повторов плазмидной части, обеспечивающих необходимую для упаковки ДНК протяженность генома.