45. Механизм сплайсинга тРнк. ТРнк-лигаза.

Механизм удаления интронов в тРНК лучше всего изучен у дрожжей, но некоторая информация получена в опытах с другими низшими эукариотами и растениями.

В основе сплайсинга лежит узнавание вторичной структуры определенного типа, а не определенной нуклеотидной последовательности.

Специфическая тРНК-эндонуклеаза расщепляет про-тРНК в 5'-сочленении интрона с образованием циклического 2',3'-фосфодиэфира на конце 5'-половины тРНК. Тот же фермент расщепляет другое сочленение интрона с образованием 5'-гидроксильной группы на конце 3’-половины тРНК. Эти реакции напоминают расщепление под действием некоторых РНКаз. Циклический фосфодиэфир на конце 5'-экзона затем отщепляется с образованием 2'-фос-фомоноэфира под действием циклической фосфо-диэстеразы. После фосфорилирования 5'-гидроксильного конца 3’-экзон аденилируется при помощи тРНК- лигазы. После лигирования активированных концов двух частей молекулы образуется необычная 2'-фосфат-3',5'-фосфодиэфирная связь, и затем при отщеплении 2'-фосфата под действием фосфатазы получается зрелая молекула тРНК. Заметим, что фосфат, участвующий в образовании новой диэфир-ной связи, до этого входил в состав АТР-особенность, отличающая сплайсинг тРНК у дрожжей от аналогичного процесса у позвоночных В данной цепи реакций первоначальное эндонуклеозное расщепление приводит к образованию 5'-гид-роксильного и 3’-фосфомоноэфирного концов, причем последний превращается в циклический 2',3'-фосфодиэфир под действием АТР-зависимой циклазы. Затем тРНК- лигаза соединяет обе части без дополнительной активации концов. На первой стадии реакции сшивания происходит активация РНК-лигазы с участием АТФ с образованием аденилированного белка, при этом фосфатная группа АМФ ковалентно взаимодействует с адной из аминогрупп фермента.

При фракционировании системы сплайсинга дрожжей получены высокоочищенные препараты двух ферментов. Один из них катализирует эндо-нуклеазное расщепление на границах интрона; второй проявляет активность циклической фосфодиэс-теразы и киназы и способен катализировать аденилирование и лигирование, причем все эти активности принадлежат одной полипептидной цепи. Оба фермента проявляют высокую специфичность в отношении данных реакций сплайсинга тРНК, однако они неспецифически действуют на любые тРНК-ин-троны и соединяют два участка любых тРНК. И действительно, из частей молекул, принадлежащих разным тРНК, были сконструированы весьма интересные гибриды.торая до этого была концевым фосфатом АТР. У позвоночных три указанные реакции катализируют отдельные ферменты, при этом каждый фермент участвует только в сплайсинге тРНК.

.

46. Процессинг транскриптов РНК-полимеразы I. Наружные (НТС) и внутренние (ВТС) транскрибируемые спейсеры. Специфические малые ядрышковые РНК C/D и Н/АСА в реакциях 2′-О-метилирования и псевдоуридилирования рРНК.

В ядрышках протекают процессы синтеза и первичной сборки рибосомных частиц.Ранние электронномикроскопические исследования ядрышек диспергированных в растворах с низкой ионной силой позволили обнаружить целые серии структур внешне похожих на рождественскую елку. Сейчас известно, что каждая такая «рождественская елка» представляет собой одну повторяющуюся единицу рДНК (т.е. один ген рибосомной РНК из примерно 100-200 тандемно повторяющихся генов) транскрибируемую РНК-полимеразой I. Рибосомная ДНК образует ствол «дерева», синтезирующаяся пре-рРНК формирует «ветви», а комплексы процессинга, содержащие U3 snoРНК, которые быстро связываются с новосинтезированной рРНК вдали от 5^/-сайта процессинга, формируют 5^/-терминальные «шарики», которые выглядят как орнамент.

Из молекул-предшественников выщепляются 18S-, 5.8S- и 28S-рРНК, используются для образования малых и больших субчастиц рибосом. В ходе эндонуклеолитических и экзонуклеолитических реакций процессинга раличающиеся по размеру наружные(НТС) и внутренние(ВТС) транскрибируемые спейсеры удаляются и впоследствии разрушаются. Реакции расщепления протекают как в пределах самих транскрибируемых спейсеров, так и по их концам. Реакции расщепления по разным сайтам процессинга фундаментально различаются. Процессинг молекул пре-рРНК заключается не только в реакциях разрезания, но и в реакциях модификации, которым подвергаются приблизительно 200 специфических нуклеотидных остатков в составе первичного транскрипта, около 80 рибосомальных белков быстро связывается в ядрышках с пре-рРНК и несколько белков дополнительно связывается в цитоплазме с областью пре-рРНК, соответствующей 18S-фрагменту.

U3 snoРНП-комплекс важен для самой ранней стадии разрезания пре-рРНК –первое событие в процессинге пре-рРНК млекопитающих – в сайте, расположенном в пределах наружного транскрибируемого спейсера (ETS) на 5^/-конце транскрипта.U3 snoРНП-комплекс также обеспечивает разрезание во внутреннем транскрибируемом спейсере 1 (ITS1) и у дрожжей в высвобождении зрелой 18S-рРНК принимают участие U22 и U14 РНК. Молекула U14 РНК также играет роль шаперона, обеспечивая фолдинг внутренней области участка, соответствующего 18S-рРНК млекопитающих. Молекула U8 РНК участвует в разрезании транскрипта в пределах участка ITS1 и обеспечивает разрезание внешнего транскрибируемого спейсера (ETS) на 3^/-конце транскрипта. MRP расщепляет эукариотическую пре-рРНК по сайту, похожему на сайт на который действует РНКаза Р при выщеплении тРНК из прокариотической пре-рРНК. После этих специфических эндонуклеолитических разрезаний, образующиеся фрагменты подравниваются с участием 5^/→3^/- и 3^/→5^/-экзонуклеаз.

snoРНП-комплексы выполняют функцию проводников по молекулам рРНК, направляя реакции 2^/-О-метилирования по приблизительно 110 сайтам и реакции псевдоуридилирования по 95 сайтам у млекопитающих. Спаривание происходит в тех участках, которые подвергаются модификации. Молекулы snoРНК, направлящие 2^/-О-метилирование отличаются наличием последовательностей, называемых блоками С и D, которые связывают 2^/-О-метилазу. Те snoРНК, которые направляют псевдоуридилирование, содержат блоки Н и АСА и связывают псевдоуридин-синтазу. Реакции метилирования и псевдоуридилирования, ограниченные наиболее высоко консервативными последовательностями в рРНК, протекают сразу после транскрипции и вероятно согласованы с фолдингом рРНК. Процессинг пре-рРНК транскриптов зависит от участия многочисленных малых РНК, принимающих участие в модификации, разрезании и фолдинге 18S-, 5.8S- и 28S-рРНК, которые в сборке с белками экспортируются в цитоплазму для участия в процессе трансляции в качестве малых и больших субчастиц рибосом.