15. Доказательство полуконсервативного способа репликации днк. Эксперимент Месельсона и Сталя. Репликативная вилка. Одно- и двунаправленная репликация.

Синтез ДНК начинается с расхождения цепей, каждая из которых служит матрицей для синтеза дочерней цепи. Продуктами репликации являются две дочерние ДНК, каждая из которых состоит из одной родительской и одной дочерней цепи. Такой способ репликации был постулирован Уотсоном и Криком и назван полуконсервативным.

Месельсон и Сталь доказали это с помощью метода равновесной седиментации в градиенте плотности. Для этого E. coli выращивали в течение многих поколений в среде, где единственным источником азота был ¹⁵NH₄Cl. В результате, весь азот ¹⁴N, содержащийся в исходной ДНК замещался на «тяжелый» ¹⁵N.

При длительном центрифугировании пробирок, содержащих возрастающие сверху до низу концентрации хлористого цезия, молекулы ДНК переходят в ту область градиента, в которой плотность раствора равна их собственной плавучей плотности и образуют четко выраженную полосу, которую легко обнаружить по поглощению в ультрафиолете.

В результате одного цикла репликации ДНК дает одну полосу. Отсутствие полосы, характерной для чистой ¹⁵N-ДНК говорило о том, что целостность родительской (¹⁵N-ДНК) ДНК в ходе одного акта репликации нарушается. Отсутствие полосы, характерной для чистой ¹⁴N-ДНК доказывало, что часть атомов во всех дочерних молекулах ДНК (гибриды, состоящие из ¹⁴N-ДНК и ¹⁵N-ДНК) происходит от родительской (¹⁵N-ДНК) ДНК. После второго акта репликации были получены две полосы ДНК, одна из которых соответствовала гибридной ДНК, а вторая – чистой ¹⁴N-ДНК.

Репликативная вилка – участок ДНК, имеющий Y-образную форму, который служит местом синтеза новых цепей ДНК при репликации. Репликативная вилка движется последовательно вдоль ДНК от стартовой точки - точки начала репликации.

Репликация может осуществляться либо в одном, либо в двух направлениях от стартовой точки. При однонаправленной репликации вдоль ДНК движется одна репликативная вилка. При двунаправленной репликации от точки начала в противоположных направлениях движутся две репликативные вилки.

Область, которая уже реплицирована, имеет вид глазка внутри нереплицированной ДНК. Этот глазок выглядит одинаково как в случае одной, так и в случае двух репликативных вилок. Если репликация двунаправленная, перемещаться будут оба конца глазка.

16. Типы репликации. Репликация кольцевых днк с образованием глазка. -структура. Репликация по типу катящегося кольца (репликация днк фагов м13, х174, ). Репликация с образованием d-петель.

В кольцевых молекулах ДНК репликационный глазок образует -структуру. Появившийся глазок постепенно расширяется по мере продвижения репликативной вилки, формируя -структуру. Нереплицированный сегмент уменьшается, что завершается разделением двух дочерних молекул ДНК.

Репликация по типу катящегося кольца: двухцепочечная кольцевая ДНК надрезается специфическим ферментом в уникальном сайте только одной цепи, и к образовавшемуся в результате надреза 3`-OH-концу с участием ДНК-полимеразы  присоединяются дезоксинуклеотиды. Вследствие того, что матрицей служит интактная замкнутая цепь ДНК, в вилке синтезируется только лидирующая цепь. По мере синтеза лидирующей цепи происходит вытеснение 5^/-конца исходной надрезанной родительской цепи. У фагов М13 или Х174, чьи зрелые геномы представлены одноцепочечными кольцевыми ДНК, данный способ репликации используется на поздних стадиях инфекционного процесса, после того как геномная кольцевая ДНК превращается в двухцепочечную форму. Постоянно отделяющиеся в результате репликации одиночные цепи ДНК приводят к образованию серии геномов, которые затем фрагментируются и встраиваются в фаговые частицы в виде одноцепочечных замкнутых зрелых форм. Освобождаемая отдельная цепь катящегося кольца может быть превращена в двухцепочечную ДНК путем синтеза комплементарной цепи - двухцепочечные конкатемерные молекулы, необходимые для созревания ДНК фага . На ранних стадиях инфицирования линейная вирусная ДНК превращается в кольцевую репликативную форму. Для образования линейной ДНК двухцепочечные кольца надрезаются и реплицируются, но вытесняемые одиночные цепи превращаются в двухцепочечные структуры. При упаковке ДНК в фаговые частицы в специальных участках конкатемеров (cos-сайтах) происходит разрезание.

Репликация с образованием D-петель: Репликация митохондриальных, хлоропластных ДНК начинается в специфической точке Ori_R. Cинтез инициируется путем образования праймерной РНК. Первоначально только одна цепь (H-цепь) используется как матрица для синтеза новой цепи. Синтез происходит только на коротком участке и вызывает вытеснение исходной комплементарной L-цепи, которая остается одноцепочечной – образуется D-петля. Вытесняемая часть L-цепи становится длиннее и расширяет D-петлю. Расширение продолжается до тех пор, пока не достигнет 67% длины кольца. Происходит раскрытие точки начала репликации в L-цепи. В сайте Ori_D инициируется синтез Н-цепи в противоположном направлении с использованием вытесненной L-цепи в качестве матрицы. Из-за задержки репликации дочерняя H-цепь синтезируется только на 30-40% длины кольца. В результате освобождается одна полная двухцепочечная кольцевая ДНК и одна кольцевая молекула, содержащая брешь. Далее брешь заделывается и остающиеся разрывы сшивается с участием лигаз.

17. ДНК-полимеразы E. coli (I, II, III, IV и V). Сравнительная характеристика ДНК-полимераз. ДНК-полимераза III – основной фермент репликации. Понятие процессивности.

Днк-полимераза I – не является основополагающим ферментом репликации, выполняет ряд доп.функций, принимает участие в репликации, рекомбинации и репарации. Скорость функционирования-60 нуклеотидов/мин. Обладает низкой процессивностью. Состоит из одной полипептидной цепи. Обладает 3-мя типами активности: полимеразной (3’), корректирующей (3’-5’-экзонуклеазной) и 5’-экзонуклеазной. Имеет 2 фрагмента: 36000Да(5’-экзонуклеазная активность) и 68000Да(полимеразная и 3’- корректирующая активность-фрагмент Кленова). Способна к Nick-трансляции- способность замещать один нуклеотид другим(с 5’-удалять, а к 3'-добавлять и т.д)

ДНК-полимераза II – не обладает 5’-экзонуклеазной активностью, обладает корректирующей и полимеразной. Принимает участие в специфическом способе репарации ДНК.

ДНК-полимераза III – основной фермент репликации. Включает 10 разных типов субъединиц. Ее холофермент состоит из двух кор-ферментов (состоят из α(полимеризующая активность) ,ε (3’-корректирующая),θ (основа для их объединения). Два кор-фермента связаны в димер с помощью γ-комплекса (состоит из τ2γδδ’χψ) – структурная часть на которой происходит сборка скользящего зажима(состоит из двух β-субъединиц). ДНК-полимераза III*-состоит из τ2γδδ’χψ, т.е она еще ненастоящая. Когда с каждым кор-ферментом взаимодейтсвуют димеры, содержащие β-субъединицы- настоящая ДНК-полимераза III. Вцелом холофермент связан с dnaB-геликазой, с помощью τ.

ДНК-полимеразы IV и V- сверхспецифические ферменты, т.к принимают участие в особых способах репарации ДНК: осуществляют репарацию, независимо от характера повреждения.

Процессивность- среднее количество нуклеотидов, присоединяемых ДНК-полимеразой за один акт связывание с матрицей.