5. Методи визначення білків в харчових продуктах

Білки, протеїни - високомолекулярні природні органічні речовини, які побудовані з амінокислот і грають фундаментальну роль у структурі і життєдіяльності організмів. Саме білки (ферменти тощо) здійснюють обмін речовин і енергетичні перетворення, нерозривно зв'язані з активними біологічними функціями. Білки входять до складу складних клітинних структур - органел. І хоча органели містять також інші речовини (ліпіди, вуглеводи, нуклеїнові кислоти, неорганічні компоненти), білки особливо важливі, бо вони є основними структуроутворювачами і відіграють ведучу роль у виконанні фізіологічних функцій живого організму.

Харчова цінність продуктів значною мірою залежить від вмісту в них азотистих речовин – білків, які складаються з залишків амінокислот. Вміст вільних амінокислот та інших форм азоту – наслідок побічних процесів (ферментативних), які відбуваються під час переробки або зберігання продуктів.

В хімічних аналізах визначають загальну кількість азоту, перераховують його на білок. Для цього отриману кількість азоту множать на коефіцієнти відповідно виду продукту, виходячи з того, що в білках у середньому міститься 15-19% азоту.

Умовність отриманих результатів очевидна, тому що не весь азот харчового продукту знаходиться у формі білка, крім того відсотковий вміст азоту в білку коливається від значення 15% і вище. В деяких випадках азотисті речовини небілкового характеру досягають значної кількості. Так, у м’язовій тканині риб їх міститься до 15%, тоді як в м’язах тварин - 10-16 % від загальної кількості азотистих речовин.

5.1 Арбітражний метод визначення масової частки загального азоту Метод К’єльдаля використовують для дослідження білків, нуклеїнових кислот, алкалоїдів, фосфатидів й інших азотовмісних речовин у продуктах рослинного та тваринного походження, а також для перевірки інших методів визначення білка.

Метод ґрунтується на руйнуванні органічних сполук під дією киплячої сірчаної кислоти. Органічні сполуки при нагріванні з концентрованою сірчаною кислотою окислюються до води, діоксиду вуглецю. При цьому із азоту амінокислот отримуємо аміак, який з сірчаною кислотою утворює сульфат амонію. Цей метод розроблений в 1883 році датським хіміком Іоганном К’єльдалєм, і був названий його ім'ям.

Метод уявляє собою дуже трудомісткий і тривалий аналіз, і тому в сучасній лабораторній практиці метод К’єльдаля часто намагаються замінити альтернативними методами визначення білку, у тому числі, з використанням дорогих програмно-апаратних комплексів. Але метод К’єльдаля, незважаючи на його складність, дотепер залишається єдиним загальновизнаним арбітражним методом визначення білка і найчастіше використовується в якості еталонного для калібрування і настроювання інших методик аналізу сировини і готової продукції. Тому апарати для визначення білку за методом К’єльдаля є практично в кожній лабораторії для аналізу харчової продукції, а альтернативні методики застосуються тільки як допоміжні. Для підприємства, що організовує роботу спеціалізованих лабораторій, безумовно, кращим є саме метод К’єльдаля. Методу К’єльдаля, не дивлячись на більш ніж 120-річню історію, дотепер не знайдено гідної альтернативи. Причиною тому - висока специфічність обраної реакції окислювання білка сірчаною кислотою, у результаті якої руйнуються пептидні зв'язки в його молекулі й утворюються іони амонію, що у наступному можуть бути легко проаналізовані стандартними методами. Однак відтворюваність і точність методу К’єльдаля в значній мірі залежить від досвіду аналітика. Прагнучи звести до мінімуму вплив людського фактора на результати аналізу, прискорити виконання методики і підвищити її безпеку, виробники аналітичного устаткування розробили спеціалізовані комплекти устаткування для аналізу за методом К’єльдаля.

Метод містить у собі кілька основних етапів: добір і підготовку проб, мокре озолення, відгін з парою і визначення концентрації амонію (фотометрично чи титрометрично). Для кожного етапу передбачені свої апаратні рішення, що у даний час фактично стали стандартом де-факто і практично цілком замінили дії, які виконувались лаборантом вручну.

Виділення азоту проводиться шляхом мінералізації (спалювання) маси наважку виробу сірчаною кислотою у присутності каталізатора (сірчанокислої міді, перекису водню, селену тощо).

При цьому всі органічні речовини окислюються киснем, який утворюється під час розпаду сірчаного ангідриду, що виділився. При спалюванні маси наважки виділяється аміак, який зв’язується надлишком сірчаної кислоти з утворенням сірчанокислого амонію. Під впливом концентрованого розчину гідроксиду натрію із сірчанокислого амонію виділяється аміак (реакції 1-4).

У присутності надлишку розчину гідроксиду натрію аміак переганяють у титрований розчин сірчаної кислоти і по масі, яка зв’язалася з аміаком сірчаної кислоти, визначають масову частку загального азоту в масі наважки.

Після визначення масової частки загального азоту в масі наважки визначають масову частку сирого білка.

Для визначення у продуктах масової частки сирого білка отриману масову частку загального азоту у відсотках множать на відповідний коефіцієнт. У зв’язку з тим, що масова частка азоту в білку різних продуктів є неоднакова, то коефіцієнт переліку азоту на білок також - різний. Так, для продуктів тваринного походження, картоплі та овочів коефіцієнт дорівнює 6,25; для молочних продуктів – 6,38; ячменю, кукурудзи, гречки, квасолі – 6,00; пшениці, вівса, гороху – 5,68.

Етап 1. Добір і підготовка проб

Необхідна умова одержання точних результатів аналізу по К’єльдалю - ретельна підготовка зразків. Процедура підготовки проб повинна забезпечувати гомогенізацію зразка, тому що розмір часток в аналізованих пробах не повинний перевищувати 1 мм. Однорідність зразка підвищує відтворюваність методу, а також дозволяє зменшити обсяг проби. Звичайно при використанні часток малих розмірів підвищується швидкість озолення. Для подрібнення м'яких зразків рекомендується використання спеціальних лабораторних млинів, але найчастіше буває досить звичайної кавомолки. Зважування зразків для наступного аналізу по К’єльдалю повинно проводитися на електронних вагах. Важливо знати вологість зразка і завжди аналізувати або попередньо висушені зразки, або зразки з точно встановленим вмістом вологи.

Етап 2. Мокре озолення

Самим трудомістким і тривалим етапом у методі К’єльдаля є стадія мокрого озолення, у результаті якого відбувається повне "спалювання" зразка в сірчаній кислоті.

350…380ºC

Б ілок nH₂O + n₁CO₂ + n₂SO₂ + n₃(NH₄)₂SO₄ (1)

Сірчана кислота,

каталізатори

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH Na₂SO₄ + 2H₂O + 2NH₃

N H₃ +4H₃BO₃ (NH₄)₂B₄O₇ + 5H₂O (3)

( NH₄)₂B₄O₇ + 2HCl 2NH₄Cl + H₂B₄O₇ (4)

Однак використовувати для озолення чисту сірчану кислоту недоцільно через низьку швидкість протікання процесу. Швидкість озолення і руйнування зразка залежать не тільки від властивостей кислоти, але і від температури обробки (реакція 1). Чим вище температура, тим менше часу йде на розкладання. При використанні чистої сірчаної кислоти температура озолення обмежується, в основному її точкою кипіння (338°С), у той час як для повного розкладання необхідна більш висока температура. Швидкість мокрого озолення можна значно збільшити за рахунок додавання солей і каталізаторів. У класичному приладі К’єльдаля на кожен грам зразку звичайно необхідно 25 см³ кислоти і кілька годин для проведення розкладання. Основною експлуатаційною проблемою для даної стадії аналізу є виділення великої кількості отруйних парів діоксиду і триоксиду сірки. Для збору і нейтралізації шкідливих викидів рекомендується використовувати спеціальний поглинач і вакуумний насос.

Етап 3. Відгін з парою

Отриманий після стадії розкладання прозорий розчин не можна використовувати для безпосереднього визначення в ньому амонійного азоту через великий вміст компонентів, які заважають. Для відділення амонійного азоту він переводиться в аміачну форму (додаванням лугу, реакція 2) і відганяється з парою на дистиляторах. Дистилятори можуть також використовуватися для відгону амонійного азоту безпосередньо зі зразків без їхнього попереднього розкладання, що дозволяє виділити вміст амонійного азоту з загального азоту за методом К’єльдаля.

Етап 4. Визначення вмісту амонійного азоту

Результати по визначенню білка прийнято представляти в мг/л амонійного азоту, тому метод визначення білка по К’єльдалю (що більш поширено в харчовій промисловості) ще називають методом визначення загального азоту по К’єльдалю (використовується, наприклад, в екологічному аналізі). Аміак, що переганяється з парою, збирається в колбі, в яку попередньо вносять розчин борної чи сірчаної кислоти відповідної концентрації. Отриманий чистий розчин борату чи сульфату амонію (реакція 2,3 ) може бути легко відтитровано прямим чи зворотнім методом. Якщо виконується аналіз невеликої кількості проб, то можна задовольнятися титруванням з бюретки, але для титрування великої кількості проб і для підвищення точності результатів рекомендується використовувати автоматичні титратори. Альтернативою титрометрії може стати фотометричне визначення амонійного азоту за допомогою готових реактивів.