Теоретичні основи хроматографічного аналізу

Хроматографія – це фізико-хімічний метод розділення й аналізу сумішей газів, рідин або розчинів за допомогою сорбцій них процесів. Метод ґрунтується на різному розподілі компонентів суміші між двома фазами – рухомою та нерухомою.

Речовини, що становлять нерухому фазу, називають сорбентами, які можуть бути як у твердому, так і в рідкому стані, але переважно це тверді речовини. Як сорбенти використовують силіцію оксид, силікагель, алюмінію оксид тощо.

Рухома фаза – це потік рідини або газу, що фільтрується крізь шар сорбенту. Вона виконує функції розчинника і носія суміші речовин, які аналізують, і називається сорбатом.

Розрізняють такі види хроматографії за механізмом розділення:

а) адсорбційну;

б) йонообмінну;

в) розподільну;

г) осадову.

Адсорбційна хроматографія основана на вибірковій адсорбції однієї або декількох речовин із розчинів під дією міжмолекулярних сил.

Йонообмінна хроматографія використовує відмінність констант обміну йонів між розчином і йонообмінним адсорбентом.

Розподільна хроматографія заснована на явищі розподілу розчиненої речовини між двома не змішуваними рідинними фазами.

Осадова хроматографія основана на неоднаковій розчинності важкорозчинних речовин, які утворюються компонентами суміші з осаджувачем.

Крім того, за іншими ознаками хроматографічні методи поділяють:

1. За середовищем, у якому проводять розділення: газова, газорідинна та рідинна хроматографія;

2. За формою проведення процесу: колонкова, паперова, тонкошарова, капілярна хроматографія.

Для розділення, аналізу й дослідження речовин та їх сумішей, що не розкладаються в газоподібному стані, найбільшого застосування набула газова хроматографія. Залежно від виду сорбенту, яким заповнюють хроматографічну колонку, її поділяють на газоадсорбційну та газорідинну.

У газовій хроматографії як рухому фазу (газ-носій) найчастіше використовують інертні гази.

Процес розділення й аналізу проводять за допомогою спеціальних приладів, які називають газовими хроматографами. Незважаючи на різні технічні рішення, рівень забезпечення електронними вузлами та основні технічні характеристики, принцип будови хроматографів однаковий. У кожному з них є такі основні вузли: система подавання газу-носія, пристрій для введення досліджуваної суміші, хроматографічна колонка, аналізатор (детектор), прилад для реєстрації та аналізу.

Під час проходження досліджуваної суміші через хроматографічну колонку її компоненти селективне утримуються нерухомою фазою, а потім виходять із колонки і реєструються детектором, сигнали якого автоматично записуються у вигляді хроматограми (мал. 1).

Мал. 1. Типова газова хроматограма:

А, Б — піки відповідних компонентів; t_RА і t_RБ — час утримування речовин А і Б;

h/2 — піввисота піка А; w — ширина піка А на його піввисоті.

Кожному компоненту суміші на хроматограмі відповідає окремий пік. Положення піка визначається величиною часу утримування t_R, тобто часом від початку введення проби до виходу максимального піка, або величиною утримуваного об’єму V_R, який обчислюють за формулою:

V_R = t_R•F,

де F – об’ємна швидкість газу-носія, см³/хв, см³/с.

Ідентифікацію компонентів суміші проводять шляхом зіставлення часу затримання відповідного компонента й еталону. Час затримання є хроматографічною характеристикою речовини. Збіг часу затримання еталону і досліджуваної речовини свідчить про їх ідентичність.

Визначення кількісного складу суміші полягає в тому, що інтенсивність піка кожного компонента пропорційна його вмісту в суміші. Є різні способи вимірювання площі піків. Найпростішим методом є множення висоти піка h (див. рис.1) на його ширину w, виміряну на середині висоти піка:

S = h•w.

Метод газохроматографічного аналізу дуже чутливий. Для його проведення достатньо кількох кубічних сантиметрів газу, мікролітрів рідини чи мікрограмів твердої речовини.

У методі рідинної хроматографії рухомою фазою є рідина, нерухомою – твердий адсорбент. На відміну від газової, рідинна хроматографія може бути використана для аналізу речовин з молекулярною масою від кількох сотень до кількох мільйонів, включаючи складні макромолекули нуклеїнових кислот і білків.

Залежно від характеру взаємодій, що відбуваються в шарі сорбенту, рідинну хроматографію поділяють на дві групи: молекулярну та хемосорбційну.

До першої групи відносять молекулярно-ситову, адсорбційно-рідинну та рідинно-рідинну хроматографію з відносно слабкою взаємодією в системі сорбат – сорбент – розчинник.

До другої групи належать йоннообмінна, оксидаційно-відновна, комплексоутворювальна та афінна хроматографія – з сильною взаємодією між сорбатом і сорбентом.

Молекулярна рідинна хроматографія. Під час проведення аналізу цим методом використовують колонки значно меншої довжини, ніж у газовій хроматографії. Як розчинник застосовують легкі вуглеводні та їх похідні: гексан, бензол, толуол, метанол, етанол, ацетатну кислоту тощо; їх вибір визначається типом сорбенту, яким може бути силікагель, алюмінію оксид, магнію оксид, сахароза, полімери.

Адсорбційно-рідинний та рідинно-рідинний методи хроматографії тісно пов'язані між собою, їх застосовують для розділення сумішей нуклеотидів, вітамінів, лікарських препаратів та інших складних органічних сполук.

Молекулярно-ситова (гель-фільтраційна) хроматографія ґрунтується на принципі розділення суміші речовин за розмірами їх молекул. Процес відбувається за рахунок того, що крізь цеоліт (молекулярне сито) або пори гелю можуть дифундувати тільки речовини, розміри молекул яких не перевищують розміри пор адсорбенту. Внаслідок цього молекули меншого розміру проходять більший шлях і виходять з колонки пізніше, ніж більші молекули.

Останнім часом молекулярно-ситову хроматографію широко використовують для визначення молекулярної маси білків, виділення та очищення біополімерів (білків, пептидів, поліцукридів, нуклеїнових кислот) і навіть для розділення клітин, наприклад лімфоцитів, еритроцитів тощо.

Хемосорбційна хроматографія. У біології та медицині застосовують також афінну, або біоспецифічну хроматографію. В основі цього методу лежить унікальна властивість високомолекулярних біологічноактивних сполук "упізнавати" в будь-якій суміші тільки певні, "свої" речовини і взаємодіяти з ними.

Умовно процес розділення речовин за допомогою афінної хроматографії можна представити так: колонку заповнюють носієм, міцно зв'язаним з певною біологічно активною речовиною, який у цьому разі називають лігандом, і пропускають через колонку досліджувану суміш речовин, до однієї з яких ліганд виявляє біологічну спорідненість. Ліганд вибирає із суміші тільки певну речовину і утворює з нею комплекс, завдяки чому ця речовина залишається в колонці, а інші компоненти суміші проходять через неї. Підібравши умови, за яких комплекс ліганду з обраною ним речовиною розкладається, її вимивають відповідним буферним розчином.