Приготування десятикратних розведень

Вихідна суспензія звичайно містить велику кількість мікро­організмів, тому висів на неї дасть на чашках Петрі велику кількість колоній, підрахувати які практично неможливо. Щоб зменшити кількість мікроорганізмів при висіві, вихідну суспензію розводять стерильною водою у такій кількості, щоб посіви з цих розведень давали на чашках Петрі від 20 до 600 колоній. Це розбавлення або розведення, як прийнято його називати у практиці мікробіологічних досліджень, проводять таким чином: до пробірок наливають по 10 мл води і стерилізують в автоклаві (після стерилізації у кожній пробірці залишається майже по 9 мл води). Потім стерильною піпеткою беруть 1 мл підготовленої вихідної суспензії і вносять до пробірки зі стериль­ною водою; піпетку після цього промивають 2–3 рази водою з тієї ж пробірки. Так отримують перше розведення суспензії 1:10. Після цього новою стерильною піпеткою беруть з першого розведення 2 мл і вносять таким же чином в наступну пробірку з 9 мл стерильної води, тобто готують друге розведення – 1:100. Анало­гіч­ним чином готують 3, 4 і наступні розведення.

Висів у чашки Петрі

Якщо вміст мікроорганізмів у досліджуваному субстраті невідомий, то для висіву готують стільки стерильних чашок Петрі і пробірок з відповідним живильним середовищем (частіше вико­ристо­вують МПА, сусловий агар або МПЖ), скільки було приготовано розведень вихідної суспензії.

Перед висівом пробірки з середовищами вміщують на водяну баню і нагрівають до розплавлення твердого поживного середовища. Чашки Петрі виймають з паперу, в який вони були загорнуті при стерилізації, розміщують перед собою на робочому столі і пишуть на кришці порядковий номер, розведення, найменування досліджуваного об’єкта, дату посіву і прізвище працюючого.

Для висіву стерильною піпеткою (кожен раз новою) набирають по 1 мл ретельно розмішаної вихідної суспензії або відповідного її розведення. Потім злегка підіймають край чашки Петрі і вміст піпетки переносять на середину дна чашки. Туди ж виливають з пробірки розплавлене живильне середовище (охолоджене до 45°). Круговими рухами чашки ретельно змішують живильне середовище з висівним матеріалом і залишають для застигання (корок і край пробірки перед виливанням з неї живильного середовища в чашку Петрі фламбують, тобто проводять через полум’я спиртівки чи газового пальника).

Після застигання живильного середовища чашки з висівом на агарних середовищах перевертають догори дном і ставлять у термостат при потрібній температурі, а желатинові, не перевертаючи, витримують при температурі не вище 20–22°С.

Примітка. При повторному аналізі, коли вміст мікроорганізмів у досліджуваному субстраті вже приблизно відомий, висів з чашки Петрі роблять лише з трьох останніх розведень.

Підрахунок кількості вирощених колоній (проводиться на наступному занятті)

Швидкість зростання колоній залежить від температури: чим вона ближча до оптимальної для зростання мікробів, тим швидше розвиваються колонії. У зв’язку з цим кінцевий підрахунок числа колоній проводять для бактерій на МПА при температурі 30°С через 3 доби, а при кімнатній температурі – через 7 діб; для бактерій на ПМЖ – через 7 діб; для плісняви на сусловому агарі при кімнатній температурі – через 14 діб, а при вирощуванні в термостаті – через 7 діб.

Якщо число колоній не перебільшує 100–200, їх рахують на всій поверхні чашки, для чого перевертають її догори дном і, якщо потрібно, користуються лупою. Знайдене число колоній позначають на чашці олівцем. При великій кількості колоній дно чашки Петрі ділять олівцем на декілька однакових за площею секторів і підраховують число колоній у кожному секторі, а потім знаходять їх суму. Визначивши кількість вирощених колоній у чашці Петрі для даного розведення, підраховують вміст мікроорганізмів у досліджу­ваному субстраті так: число вирощених колоній множать на розведення і одержують вміст мікроорганізмів в 1 мл вихідної суспензії. Знаючи об’єм суспензії і масу наважки, взятої для її приготування, вираховують кількість мікроорганізмів в 1 г або 1 мл продукту.