3.26. Поглощение света

В видимой области поглощают только хромопротеины (гемоглобин, миоглобин, каталаза и др.).

В УФ области все белки (кроме протаминов) имеют широкую полосу поглощения (275 – 278 нм). Свет здесь поглощается сопряженными ядрами триптофана, фенилаланина и тирозина. Коэффициент молярной экстинкции вблизи этих длин волн зависит от количества в белке хромофорных групп, содержащих сопряжённые π-электроны. Эта полоса (~ 280 нм) объясняется возбуждением π-электронов. От белка к белку эта полоса может деформироваться и смещаться т.к. зависит от аминокислотного состава. На спектр поглощения влияют различные типы комплексообразования, ионные и дипольные взаимодействия, водородные связи групп, присоединенных к хромофору, pH среды и т.д. Поглощает также пептидная связь при длине волны ~ 190 нм. Но измерениям при этой длине волны мешает поглощение боковых радикалов, поэтому спектр надо поправлять с учетом поглощения боковых групп.

Экстинкция статических клубков экспериментально оказывается выше, чем спирали (для полиглутаминовой кислоты на 42%). Уменьшение оптической плотности при переходе конформации белка от клубка к спирали, называется гипохромным эффектом. Интенсивность поглощения зависит от дипольного момента перехода. Когда белок не имеет регулярной (спиральной) структуры, дипольные моменты перехода, ориентация которых связана с ориентацией пептидных групп, никак не коррелированны, поэтому их взаимодействие компенсируется. Когда возникает спираль – пептидные группы (и дипольные моменты) ориентированы примерно параллельно. При такой пространственной ориентации между ними возникают электростатические силы, которые и приводят к ослаблению поглощения света.

3.27. Спектроскопия в инфракрасной области

С помощью метода ИК-дихроизма, когда измеряют разность поглощения света поляризованного вдоль ориентации молекул и перпендикулярно этой оси, можно определить, в какой конформации находится белковая молекула, т. е можно определить, как направлены группы CO и NH пептидных группировок по отношению к оси макромолекул. Для валентного колебания NH-группы частота равна 3330 см^-1, а для валентного колебания CO-группы частота равна 1660 см^-1. Для деформационного колебания NH группы – 1550 см^-1

В пленках с белками в α-спиральной конформации в ориентированных образцах направления валентных колебаний совпадают с направлением оси макромолекулы.

В β-пленках направления валентных колебаний перпендикулярны оси макромолекулы, в результате возникает возможность исследовать переходы от α- к β-конформации и наоборот.

По характерным сдвигам полос валентных колебаний CO-групп и деформационных колебаний NH-групп можно качественно отличать 3 конформации:

Валентные колебания СО	Деформационные колебания NH
1655-1660см-1	1530-1535см-1	Статистический клубок
1650-1655см-1	1540-1545см-1	α-спираль
1630-1635см-1	1520-1530см-1	β-форма