5.15. Денатурация и ренатурация

Денатурация ДНК сводится к разрушению двойной спирали. Нагревание раствора нативной ДНК вызывает разделение двойной спирали на две цепи, сворачивающиеся в статистические клубки. При этом значительно уменьшаются вязкость и оптическая активность.

При денатурации гипохромизм исчезает, т.е. на 30-40% возрастает интенсивность поглощения в области 260 нм [13].

Для определения средней степени перехода Θ т.е. доли звеньев, находящихся в клубкообразном состоянии, можно использовать соотношение:

,

где через и обозначено поглощение ДНК в полностью спиральном и полностью клубкообразном состоянии соответственно.

Денатурация происходит также при увеличении рН раствора до уровня, при котором разрушаются водородные связи между основаниями.

Поскольку для разрушения двух водородных связей АТ-пар требуется меньше энергии, чем для разрыва трех водородных связей GC-nap, значения температуры и рН, при которых происходит денатурация, зависят от нуклеотидного состава ДНК.

Рис.4.

1. - изменение оптической плотности

2. - изменение оптической активности

Падение характеристической вязкости

В качестве простейшей характеристики плавления данной ДНК обычно используют температуру плавления T_m, которая определяется как температура, при которой половина звеньев молекулы находится в клубкообразном состоянии. Линейная зависимость температуры плавления ДНК от содержания GC- пар дает при экстраполяции предельные значения T_m=69 С для поли-AT и 110°С для поли-GC, хорошо согласующиеся с экспериментальными значениями для соответствующих синтетических полинуклеотидов (65 и 104°С) [4].

При заданном составе растворителя температура плавления:

где через Т_AT и T_GC обозначены температуры плавления молекул ДНК, состоящих только из AT- и только из GC-nap, соответственно; x_GC— доля GC-пар.

Температура плавления ДНК растет с увеличением ионной силы раствора приблизительно пропорционально логарифму концентрации катионов. При физиологических условиях в растворе T_m=85-95°С.

T_m возрастает на 16,6°C при каждом десятикратном увеличении концентрации моновалентных ионов [13].

Кривая плавления ДНК, т.е. зависимость Θ от T, обладает тонкой структурой, если длина ДНК не превышает несколько десятков тысяч пар оснований. Особенно ярко эта тонкая структура проявляется на дифференциальной кривой плавления, т.е. зависимости . Пример такой дифференциальной кривой приведен на рис.5. Конкретный профиль плавления, который отражают такие кривые, определяется последовательностью оснований в исследуемой ДНК.

Рис. 5 Экспериментальная (1) и теоретическая (2) дифференциальные кривые плавления ДНК фага fd, содержащего 2528 пар оснований.

Теоретический и экспериментальный анализы показали, что пики на дифференциальных кривых плавления связаны с выплавлением в интервале в несколько десятых градуса отдельных участков молекулы с характерным размером в несколько сотен пар оснований.

Кольцевые замкнутые ДНК, фигурирующие в фагах и бактериях, вследствие топологической невозможности свободного раскручивания с образованием петель, должны плавиться при более высокой температуре, чем те же ДНК в линейной форме.

Денатурация - процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатурацией или отжигом, происходит при понижении температуры или рН. Если температура или рН понижаются постепенно, то цепи соединяются правильно, с восстановлением всех исходных пар оснований. При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей.

Как и в случае ДНК, двухцепочечные участки в РНК разрушаются при повышении температуры или рН, но, в отличие от ДНК, при высоких значениях рН в РНК разрушаются и фосфодиэфирные связи. Поскольку протяженность спирализованных участков в одноцепочечной РНК невелика, а сами спирали несовершенны, разрушаются они довольно легко. Однако полностью комплементарная двухцепочечная РНК плавится в довольно узком температурном интервале, как и двухцепочечная ДНК.